免疫PCR试验方法
免疫pcr试验方法（一）材料与方法
1.*标记特异性抗体的制备免疫球蛋白(如igg、igm)的fc片段上有糖基存在，因而可用能与糖基结合的biotin-hydrazide作*标记。
(1) 将纯化的抗体(igm或igg， 0.1~1.0ml)在标记缓冲液(0.1mol/l naac，ph值5.5， 0.1mol/l nacl)中4℃透析放置一晚。
(2)吸取0.5ml至微量离心管中，加过酸钠溶液至终浓度为10mmol/l，置冰浴上于暗处孵育30min，使抗体分子上的糖基氧化。
(3)将氧化的抗体过pbs平衡的sephadex g25 pd-10预装柱，使之与过酸钠分开。收集蛋白峰。
(4)向抗体管中加入biotin-lc-hydrazide(pierce)至终浓度5mmol/l，置混摇器上室温孵育1h。
(5)用含0.02%nan3的pbs平衡sephadex g25预装柱，将*标记的抗体分子过柱与游离的*分开。收集蛋白峰，保存-20℃。
2.*标记dna片段的制备作为将与抗体偶联的报告dna片段，应确保在待测抗原来源的机体dna中无同源序列，如可选用大肠杆菌的序列作为报告dna去检测人源的标本。dna片段大小为300~500bp，*标记可采用pcr方法，根据报告dna的核苷酸序列合成一对引物，其中一个引物的5’端碱基上带有*标记。
在0.5mlpcr管中按表将下列试剂混合。
表pcr系统组成
试 剂
添加量
终浓度
10×pcr缓冲液
10.0ul
1×
2.5mm 4dntp混合物
8.0ul
0.2mm
50um*标记的上游引物
1.0ul
0.5um
50um*标记的下游引物
1.0ul
0.5um
15mm模板dna
1.0ul
1.0ug
taq dna聚合酶
1.0ul
5u
加水至 100ul
混匀后上面覆盖液体石蜡。
95℃加热5min，然后在pcr仪上按下列程序扩增：94℃ 1min;55℃ 1min;72℃ 1min; 40个循环。后72℃延伸10min。
加等量酚-氯仿抽提，然后加10ul 3mol/l kac，250ul无水乙醇，置-70℃30min。
离心沉淀dna片段，用70%乙醇洗一次。
将沉淀dna干燥后溶于te缓冲液中，保存在-20℃。
3.制备抗体-亲和素-dna复合物将*标记的抗体与亲和素按等分子浓度混合于含有1mg/mlbsa的pbs中，室温孵育30min，再加入两倍分子浓度的*标记的dna片段，继续孵育30min，后加入10倍分子浓度的*，将亲和素分子上的结合部位饱和。后过凝胶过滤柱将复合物与未结合的单体分开，加入bsa达1mg/ml，分装后冻存于-20℃。
4.免疫pcr
（1） 按常规elisa方法，用饱和缓冲液稀释抗原，加到96孔塑料板或0.5mlpcr管中，4℃放置一晚。
（2） 用pbs洗三次，然后每孔加200ul封闭液（pbs含10mg/ml bsa，1mg/ml鱼精dna），室温孵育30min。
（3） 用tetbs（其配方：20mmol/l edta，0.02%nan3）洗三次。
（4） 将抗体-亲和素-dna复合物稀释于含有1mg/mlbsa和0.1mg/ml鱼精dna的tetbs中，每孔加50ul，室温孵育1h。
（5） 用tetbs洗5次，然后将塑料板或管倒置在吸水纸上拍打以控干水分。
（6） 每管中加50ulpcr反应液，含有表成分：
试 剂
添加量
终浓度
10×pcr缓冲液
5.0μl
1×
2.5mm 4dntp混合物
4.0μl
0.2mm
50um*标记的上游引物
0.5μl
0.5um
50um*标记的下游引物
0.5μl
0.5um
15mm模板dna
0.5μl
1.5ug
taq dna聚合酶
0.5μl
2.5u
加水至50μl
混匀后上面覆盖液体石蜡。
95℃加热5min，然后在pcr仪上按下列程序扩增35个循环：94℃ 1min;55℃ 1min; 72℃ 1min。后72℃延伸10min。
每管取5ul作琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙锭染色后观察结果，如在pcr时加入了放射性核素标记，则可用x光片显影。
亦可在凝胶电泳后做southern-blot，用特异性探针杂交，进一步提高其特异性和敏感性。
(二)注意事项
本实验的关键步骤是获得适当的抗体-dna复合物。用链亲和素将*标记的抗体与*标记的dna偶联的方法，因每个链亲和素分子可与四个*分子结合，因此要优化反应条件，以使得每个链亲和素分子既能结合上抗体分子，又能结合上dna片段。
此外，还可用化学方法将dna片段与抗体分子共价偶联，即将抗体分子和5’端氨基酸修饰的dna片段分别用不同的双功能偶联剂激活，然后通过自发的反应偶联到一起，比如，用n-succinimidyl-s-acetyl thioacetate(sata)活化氨基修饰的dna片段，用sulfo-succinimidyl4-(maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate(sulfo-smcc)修饰抗体分子，然后将二者在一小管中混合，通过加入盐酸胲（hydroxylamine hydrochloride）使二者偶联在一起。
免疫pcr具有高敏感性。因此，抗体和标记dna的任何非特异性结合均可导致严重的本底问题。因而在加入抗体和标记dna后必须尽可能*地清洗。即使有些特异性结合的抗体或标记dna被洗掉了，亦可在后通过增加pcr的循环次数得到弥补。此外，应用有效的封闭剂对防止非特异性结合也是非常重要的。可用脱脂奶粉和牛血清白蛋白做蛋白封闭剂，用鱼精dna做核酸封闭剂。防止本底信号的另一个重要因素是控制污染，这也是所有敏感的检测系统存在的问题。即使每一步试验都做得非常认真，重复使用同样的引物和标记dna均会产生假阳性信号。
免疫pcr的一个优点是标记dna序列*是人为选定。因此标记dna及其引物可经常变换，以避免由于污染造成的假阳性信号。
免疫pcr可以检测到常规免疫学方法无法检测的样品。因此，应用免疫pcr可在微观水平（单细胞）检测抗原，定量pcr产物可以估计某一标本中的抗原数量，在临床诊断中可在疾病早期抗原量很低时检测到微量的抗原。
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1.*标记特异性抗体的制备免疫球蛋白(如igg、igm)的fc片段上有糖基存在，因而可用能与糖基结合的biotin-hydrazide作*标记。
(1) 将纯化的抗体(igm或igg， 0.1~1.0ml)在标记缓冲液(0.1mol/l naac，ph值5.5， 0.1mol/l nacl)中4℃透析放置一晚。
(2)吸取0.5ml至微量离心管中，加过酸钠溶液至终浓度为10mmol/l，置冰浴上于暗处孵育30min，使抗体分子上的糖基氧化。
(3)将氧化的抗体过pbs平衡的sephadex g25 pd-10预装柱，使之与过酸钠分开。收集蛋白峰。
(4)向抗体管中加入biotin-lc-hydrazide(pierce)至终浓度5mmol/l，置混摇器上室温孵育1h。
(5)用含0.02%nan3的pbs平衡sephadex g25预装柱，将*标记的抗体分子过柱与游离的*分开。收集蛋白峰，保存-20℃。
2.*标记dna片段的制备作为将与抗体偶联的报告dna片段，应确保在待测抗原来源的机体dna中无同源序列，如可选用大肠杆菌的序列作为报告dna去检测人源的标本。dna片段大小为300~500bp，*标记可采用pcr方法，根据报告dna的核苷酸序列合成一对引物，其中一个引物的5’端碱基上带有*标记。
在0.5mlpcr管中按表将下列试剂混合。
表pcr系统组成
试 剂
添加量
终浓度
10×pcr缓冲液
10.0ul
1×
2.5mm 4dntp混合物
8.0ul
0.2mm
50um*标记的上游引物
1.0ul
0.5um
50um*标记的下游引物
1.0ul
0.5um
15mm模板dna
1.0ul
1.0ug
taq dna聚合酶
1.0ul
5u
加水至 100ul
混匀后上面覆盖液体石蜡。
95℃加热5min，然后在pcr仪上按下列程序扩增：94℃ 1min;55℃ 1min;72℃ 1min; 40个循环。后72℃延伸10min。
加等量酚-氯仿抽提，然后加10ul 3mol/l kac，250ul无水乙醇，置-70℃30min。
离心沉淀dna片段，用70%乙醇洗一次。
将沉淀dna干燥后溶于te缓冲液中，保存在-20℃。
3.制备抗体-亲和素-dna复合物将*标记的抗体与亲和素按等分子浓度混合于含有1mg/mlbsa的pbs中，室温孵育30min，再加入两倍分子浓度的*标记的dna片段，继续孵育30min，后加入10倍分子浓度的*，将亲和素分子上的结合部位饱和。后过凝胶过滤柱将复合物与未结合的单体分开，加入bsa达1mg/ml，分装后冻存于-20℃。
4.免疫pcr
（1） 按常规elisa方法，用饱和缓冲液稀释抗原，加到96孔塑料板或0.5mlpcr管中，4℃放置一晚。
（2） 用pbs洗三次，然后每孔加200ul封闭液（pbs含10mg/ml bsa，1mg/ml鱼精dna），室温孵育30min。
（3） 用tetbs（其配方：20mmol/l edta，0.02%nan3）洗三次。
（4） 将抗体-亲和素-dna复合物稀释于含有1mg/mlbsa和0.1mg/ml鱼精dna的tetbs中，每孔加50ul，室温孵育1h。
（5） 用tetbs洗5次，然后将塑料板或管倒置在吸水纸上拍打以控干水分。
（6） 每管中加50ulpcr反应液，含有表成分：
试 剂
添加量
终浓度
10×pcr缓冲液
5.0μl
1×
2.5mm 4dntp混合物
4.0μl
0.2mm
50um*标记的上游引物
0.5μl
0.5um
50um*标记的下游引物
0.5μl
0.5um
15mm模板dna
0.5μl
1.5ug
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95℃加热5min，然后在pcr仪上按下列程序扩增35个循环：94℃ 1min;55℃ 1min; 72℃ 1min。后72℃延伸10min。
每管取5ul作琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙锭染色后观察结果，如在pcr时加入了放射性核素标记，则可用x光片显影。
亦可在凝胶电泳后做southern-blot，用特异性探针杂交，进一步提高其特异性和敏感性。
(二)注意事项
本实验的关键步骤是获得适当的抗体-dna复合物。用链亲和素将*标记的抗体与*标记的dna偶联的方法，因每个链亲和素分子可与四个*分子结合，因此要优化反应条件，以使得每个链亲和素分子既能结合上抗体分子，又能结合上dna片段。
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