荧光定量PCR实验步骤
*关键词：荧光定量pcr耗材，实验室耗材，pcr管，pcr板，本生生物pcr耗材
荧光定量pcr实验步骤：
①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其*溶解。
②两相分离 每1ml的trizol试剂裂解的样品中加入0.2ml的lvfang，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚lvfang相，中间层以及无色水相上层。rna全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的trizol试剂的60%。
③rna沉淀 将水相上层转移到一干净无rna酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的rna，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的rna沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④rna清洗 移去上清液，每1mltrizol试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用depch2o配制)，清洗rna沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤rna干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使rna沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解rna沉淀 溶解rna时，先加入无rna酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其*溶解，获得的rna溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法测定
先用稀释用的te溶液将分光光度计调零。然后取少量rna溶液用te稀释(1:100)后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定rna溶液 浓度和纯度。
① 浓度测定
a260下读值为1表示40 μg rna/ml。样品rna浓度(μg/ml)计算公式为：a260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下：
rna溶于40 μl depc水中，取5ul，1:100稀释至495μl的te中，测得a260 = 0.21
rna 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl
取5ul用来测量以后，剩余样品rna为35 μl，剩余rna总量为：
35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg
②纯度检测
rna溶液的a260/a280的比值即为rna纯度，比值范围1.8到2.1。
2)变性琼脂糖凝胶电泳测定
①制胶
1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× mops电泳缓冲液和18 ml的37% *(12.3 m)。
灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×mops电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
②准备rna样品
取3μgrna，加3倍体积的甲醛上样染液，加eb于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
③电泳
上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5–6v/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。
④紫外透射光下观察并拍照
28s和18s核糖体rna的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提rna的物种类型)，上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的rna(trna和5s核糖体rna)组成。在18s和28s核糖体带之间可以看到一片弥散的eb染色物质，可能是由mrna和其它异型rna组成。rna制备过程中如果出现dna污染，将会在28s核糖体rna带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，rna的降解表现为核糖体rna带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。 ①反应体系 序号 反应物 剂量 1 逆转录buffer 2μl 2 上游引物 0.2μl 3 下游引物 0.2μl 4 dntp 0.1μl 5 逆转录酶mmlv 0.5μl 6 depc水 5μl 7 rna模版 2μl 8 总体积 10μl 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②混合液在加入逆转录酶mmlv 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。
③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cdna溶液，保存于-80℃待用。 管家基因(β-actin)实时定量pcr
①β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl按10倍稀释(加水27μl并充分混匀)为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。
②反应体系如下：
标准品反应体系 序号 反应物 剂量 1 sybr green 1 染料 10μl 2 阳性模板上游引物f 0.5μl 3 阳性模板下游引物r 0.5μl 4 dntp 0.5μl 5 taq酶 1μl 6 阳性模板dna 5μl 7 ddh2o 32.5μl 8 总体积 50μl 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
管家基因反应体系： 序号 反应物 剂量 1 sybr green 1 染料 10μl 2 内参照上游引物f 0.5μl 3 内参照下游引物r 0.5μl 4 dntp 0.5μl 5 taq酶 1μl 6 待测样品cdna 5μl 7 ddh2o 32.5μl 8 总体积 50μl 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。 ①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cdna模板进行pcr反应。
反应体系： 序号 反应物 剂量 1 10×pcr缓冲液 2.5 ul 2 mgcl2溶液 1.5 ul 3 上游引物f 0.5 ul 4 下游引物r 0.5 ul 5 dntp混合液 3 ul 6 taq聚合酶 1 ul 7 cdna 1 ul 8 加水至总体积为 25ul 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
35个pcr循环(94℃1分钟;55℃1分钟;72℃1分钟); 72℃延伸5分钟。
②pcr产物与 dna ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测pcr产物是否为单一特异性扩增条带。
③将pcr产物进行10倍梯度稀释: 设定pcr产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。 ①所有cdna样品分别配置实时定量 pcr反应体系。
体系配置如下： 序号 反应物 剂量 1 sybr green 1 染料 10 ul 2 上游引物 1ul 3 下游引物 1ul 4 dntp 1ul 5 taq聚合酶 2ul 6 待测样品cdna 5ul 7 ddh2o 30ul 8 总体积 50 ul 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②将配制好的pcr反应溶液置于realtime pcr仪上进行pcr扩增反应。反应条件为：93℃2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，后72℃7分钟延伸。 各样品的目的基因和管家基因分别进行realtime pcr反应。pcr产物与 dna ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，goldview染色，检测pcr产物是否为单一特异性扩增条带。
终归属权：本生(天津)健康科技有限公司 ，以上资料仅供参考!
多组份烟气分析仪 使用说明
重庆渝北区到肥西物流专线直达货运_重庆渝北区到合肥肥西物流公司
太原到阿拉善左旗专线物流_太原到阿拉善阿拉善左旗物流货运
用树脂吸附技术除铜镍钴
手机销量低于预期 苹果将放弃自动驾驶汽车项目？
荧光定量PCR实验步骤
天津到广饶专线物流[直达运输]_天津到东营广饶物流专线公司
济南到南京雨花台区物流专线货运直达,济南到雨花台区专线物流公司
引起金属管浮子流量计误差较大的几个原因
CO2激光镜片使用注意事项
旋转编码器
新昌到杭州拱墅区专线物流公司_新昌到拱墅区专线货运直达运输
知识分享：车库虹吸排水板的施工步骤
福州到锡林郭勒物流专线「专业服务」_福州到锡林郭勒物流专线运输
青岛到武汉蔡甸区货运专线_青岛到蔡甸区物流公司「专线直达」
互感器特性综合测试仪生产商以您一起研究我国仪器仪表发展的战略
C4钢球阀的主要特点和主要零部件材料以及主要外形尺寸
二手20米复合肥生产线使用效率高
数控机床导轨的技术要求和分类
鱼肉松水分检测仪操作说明书
荧光定量pcr实验步骤：
①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其*溶解。
②两相分离 每1ml的trizol试剂裂解的样品中加入0.2ml的lvfang，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚lvfang相，中间层以及无色水相上层。rna全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的trizol试剂的60%。
③rna沉淀 将水相上层转移到一干净无rna酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的rna，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的rna沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④rna清洗 移去上清液，每1mltrizol试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用depch2o配制)，清洗rna沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤rna干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使rna沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解rna沉淀 溶解rna时，先加入无rna酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其*溶解，获得的rna溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法测定
先用稀释用的te溶液将分光光度计调零。然后取少量rna溶液用te稀释(1:100)后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定rna溶液 浓度和纯度。
① 浓度测定
a260下读值为1表示40 μg rna/ml。样品rna浓度(μg/ml)计算公式为：a260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下：
rna溶于40 μl depc水中，取5ul，1:100稀释至495μl的te中，测得a260 = 0.21
rna 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl
取5ul用来测量以后，剩余样品rna为35 μl，剩余rna总量为：
35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg
②纯度检测
rna溶液的a260/a280的比值即为rna纯度，比值范围1.8到2.1。
2)变性琼脂糖凝胶电泳测定
①制胶
1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× mops电泳缓冲液和18 ml的37% *(12.3 m)。
灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×mops电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
②准备rna样品
取3μgrna，加3倍体积的甲醛上样染液，加eb于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
③电泳
上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5–6v/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。
④紫外透射光下观察并拍照
28s和18s核糖体rna的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提rna的物种类型)，上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的rna(trna和5s核糖体rna)组成。在18s和28s核糖体带之间可以看到一片弥散的eb染色物质，可能是由mrna和其它异型rna组成。rna制备过程中如果出现dna污染，将会在28s核糖体rna带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，rna的降解表现为核糖体rna带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。 ①反应体系 序号 反应物 剂量 1 逆转录buffer 2μl 2 上游引物 0.2μl 3 下游引物 0.2μl 4 dntp 0.1μl 5 逆转录酶mmlv 0.5μl 6 depc水 5μl 7 rna模版 2μl 8 总体积 10μl 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②混合液在加入逆转录酶mmlv 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。
③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cdna溶液，保存于-80℃待用。 管家基因(β-actin)实时定量pcr
①β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl按10倍稀释(加水27μl并充分混匀)为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。
②反应体系如下：
标准品反应体系 序号 反应物 剂量 1 sybr green 1 染料 10μl 2 阳性模板上游引物f 0.5μl 3 阳性模板下游引物r 0.5μl 4 dntp 0.5μl 5 taq酶 1μl 6 阳性模板dna 5μl 7 ddh2o 32.5μl 8 总体积 50μl 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
管家基因反应体系： 序号 反应物 剂量 1 sybr green 1 染料 10μl 2 内参照上游引物f 0.5μl 3 内参照下游引物r 0.5μl 4 dntp 0.5μl 5 taq酶 1μl 6 待测样品cdna 5μl 7 ddh2o 32.5μl 8 总体积 50μl 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。 ①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cdna模板进行pcr反应。
反应体系： 序号 反应物 剂量 1 10×pcr缓冲液 2.5 ul 2 mgcl2溶液 1.5 ul 3 上游引物f 0.5 ul 4 下游引物r 0.5 ul 5 dntp混合液 3 ul 6 taq聚合酶 1 ul 7 cdna 1 ul 8 加水至总体积为 25ul 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
35个pcr循环(94℃1分钟;55℃1分钟;72℃1分钟); 72℃延伸5分钟。
②pcr产物与 dna ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测pcr产物是否为单一特异性扩增条带。
③将pcr产物进行10倍梯度稀释: 设定pcr产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。 ①所有cdna样品分别配置实时定量 pcr反应体系。
体系配置如下： 序号 反应物 剂量 1 sybr green 1 染料 10 ul 2 上游引物 1ul 3 下游引物 1ul 4 dntp 1ul 5 taq聚合酶 2ul 6 待测样品cdna 5ul 7 ddh2o 30ul 8 总体积 50 ul 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②将配制好的pcr反应溶液置于realtime pcr仪上进行pcr扩增反应。反应条件为：93℃2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，后72℃7分钟延伸。 各样品的目的基因和管家基因分别进行realtime pcr反应。pcr产物与 dna ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，goldview染色，检测pcr产物是否为单一特异性扩增条带。
终归属权：本生(天津)健康科技有限公司 ，以上资料仅供参考!
多组份烟气分析仪 使用说明
重庆渝北区到肥西物流专线直达货运_重庆渝北区到合肥肥西物流公司
太原到阿拉善左旗专线物流_太原到阿拉善阿拉善左旗物流货运
用树脂吸附技术除铜镍钴
手机销量低于预期 苹果将放弃自动驾驶汽车项目？
荧光定量PCR实验步骤
天津到广饶专线物流[直达运输]_天津到东营广饶物流专线公司
济南到南京雨花台区物流专线货运直达,济南到雨花台区专线物流公司
引起金属管浮子流量计误差较大的几个原因
CO2激光镜片使用注意事项
旋转编码器
新昌到杭州拱墅区专线物流公司_新昌到拱墅区专线货运直达运输
知识分享：车库虹吸排水板的施工步骤
福州到锡林郭勒物流专线「专业服务」_福州到锡林郭勒物流专线运输
青岛到武汉蔡甸区货运专线_青岛到蔡甸区物流公司「专线直达」
互感器特性综合测试仪生产商以您一起研究我国仪器仪表发展的战略
C4钢球阀的主要特点和主要零部件材料以及主要外形尺寸
二手20米复合肥生产线使用效率高
数控机床导轨的技术要求和分类
鱼肉松水分检测仪操作说明书