【NEPA21 文献】利用黄热病病毒复制子构建SARS-CoV-2 repRNA疫苗及其检测
由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(sars-cov-2)感染引起的2019冠状病毒病大流行是一种全球性威胁。sars-cov-2的主要传播途径包括咳嗽、打喷嚏和呼吸道飞沫以及气溶胶等。症状轻的患者可在10天后康复，而严重者因肺泡损伤而出现间歇性呼吸衰竭导致死亡，因此为了预防大流行，开发安全有效的疫苗是极有必要的。
2022年，日本科学家在国际科学期刊plos one上发表了题为“construction and evaluation of a selfreplicative rna vaccine against sars-cov-2 using yellow fever virus replicon”的文章，该研究将编码sars-cov-2刺突(s)蛋白的基因插入到黄热病病(yfv)毒株复制子中，构建并检测了一种reprna疫苗，复制子rna (reprna)是一种安全、有效的疫苗，该疫苗不仅编码抗原基因，还编码rna复制所需的基因并且自我复制，因此可以引起强大的免疫力。
在本研究中，作者在yfv复制子中构建了含有sars-cov-2 （s）蛋白编码区的reprna疫苗（图1a），同时也构建了non-reprna疫苗（图1b）。
采用nepa21电穿孔器(nepagene)将reprna和non-reprna疫苗电穿孔至幼鼠肾细胞(bhk)。转染后48 小时，通过western blotting法证实s蛋白在bhk细胞中的表达，同时免疫荧光法证实s蛋白与yfv蛋白共表达。作者采用了real-time rt-pcr验证reprna疫苗在bhk细胞中的自我复制能力。然后对6周龄雌性c57bl/6小鼠分别于第0、28、56天经腹腔注射reprna疫苗、non-reprna疫苗各1μg，同时利用nepa21电穿孔器向小鼠大腿处提供电脉冲，增强rna疫苗的递送。然后通过elisa法检测了sars - cov - 2s的igg抗体以及yfv非结构蛋白1 (ns1)抗体水平。此外，作者制备了s蛋白假型荧光素酶报告慢病毒作为评价小鼠体液免疫的工具，为了验证yfv复制子骨干系统和体内rna电穿孔免疫的充分性，构建了denv含有包膜(e)基因的yfv复制子，并采用与sars-cov-2 reprna疫苗基本相同的方法进行了评估。第三次接种后20天，从小鼠身上分离脾脏淋巴细胞。利用这些脾细胞，采用单色酶联免疫吸附斑点法(immunospot)进行酶联免疫吸附斑点(elispot)检测。
通过上述一系列实验，成功生成了一种编码reprna疫苗的dna质粒，该质粒在yfv复制子中含有s蛋白的外结构域（图1a）。western blotting法证实了reprna和non-reprna在细胞内表达s蛋白(图2a)，但reprna表达的s蛋白明显高于non-reprna, non-reprna几乎检测不到s蛋白(图2b)。此外，利用实时rt-pcr检测转染细胞中rna水平的动力学，以探究reprna疫苗的自我复制能力。在转染后24-96小时，与未转染reprna疫苗的细胞相比，转染reprna疫苗的细胞中rna水平显著升高(图2d)。这些数据表明，reprna疫苗构建成功且具有自我复制能力，证明了其疫苗效力。
图1、reprna与non-reprna疫苗的构建
图2、reprna和non-reprna疫苗的体外检测
为了进一步研究细胞免疫的诱导作用，在第三次免疫后20天采集接种sars-cov-2小鼠的脾细胞，并进行elispot检测。在实验模型中，reprna疫苗的免疫水平虽然有限，但与non-reprna疫苗相比，它在小鼠体内诱导了t细胞应答(图3)。
图3、reprna和non-reprna疫苗的体内检测
本实验中，研究人员借助nepa21电转染仪的基因导入功能完成了rna疫苗导入到小鼠的肾细胞中，以及对小鼠进行腿部肌肉电转提高rna疫苗的转染效果，为实验成功锦上添花。该研究证实所制备的reprna疫苗能够在体外表达s蛋白并具有自我复制能力。该疫苗在小鼠体内并没有强有力地诱导体液免疫，可能是由于s蛋白表达较低，尽管如此，还是有对s蛋白产生特异性t细胞反应的倾向。同时在诱导t细胞活化程度方面，reprna疫苗显著高于non-reprna疫苗，证实了reprna作为疫苗的有效性。然而，为了提高reprna疫苗的免疫诱导能力，后续还需要进一步优化疫苗给药方式，提高s蛋白的表达。
nepa21高效基因转染系统采用全新设计的电转程序，配合电压衰减设计，在获得高转染效率的同时，提高细胞存活率。操作简单，电转参数可见可调，适用性强。特别适用于难转染的原代免疫细胞、干细胞、神经细胞、活体动物、受精卵及宫内胚胎等的转染，多篇文献支持，是crisper/cas-9基因编辑的主流品牌电转系统！
广州市艾贝泰生物科技有限公司细胞医学部根据细胞存储、细胞治疗技术研发、应用研究等不同领域的特点，推出针对性应用技术的细胞治疗平台产品链。
文献信息：
（1）原文链接：doi.org/10.1371/journal.pone.0274829
（2）参考文献：
1、nakamura a, kotaki t, nagai y, takazawa s, tokunaga k, et al. (2022) construction and evaluation of a self-replicative rna vaccine against sars-cov-2 using yellow fever virus replicon. plos one 17(10): e0274829.
2、li p, luo z, liu p, gao n, zhang y, pan h, et al. bioreducible alginate-poly(ethylenimine) nanogels as an antigen-delivery system robustly enhance vaccine-elicited humoral and cellular immune responses. j control release. 2013; 168: 271–279.
3、erasmus jh, khandhar ap, o’connor ma, walls ac, hemann ea, murapa p, et al. an alphavirus derived replicon rna vaccine induces sars-cov-2 neutralizing antibody and t cell responses in mice and nonhuman primates. sci transl med. 2020; 12: 9396.
4、long b, carius bm, chavez s, liang sy, brady wj, koyfman a, et al. clinical update on covid-一九 for the emergency clinician: presentation and evaluation. am j emerg med. 2022; 54:46–57.
5、百科
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光谱分析技术在肉类产品检测中的应用
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PPR管与PB管的区分标准
塑料实验室氙弧灯光源的暴露试验解析
neuenhauser压缩机过热的一些常见迹象包括什么
关于气相色谱的原理和结构操作
管式炉炉膛采用高纯真空吸附高纯氧化铝微晶纤
双曲线冷却塔新建案例
防爆配电箱的使用范围及特点
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数控机床有什么特点？
2022年，日本科学家在国际科学期刊plos one上发表了题为“construction and evaluation of a selfreplicative rna vaccine against sars-cov-2 using yellow fever virus replicon”的文章，该研究将编码sars-cov-2刺突(s)蛋白的基因插入到黄热病病(yfv)毒株复制子中，构建并检测了一种reprna疫苗，复制子rna (reprna)是一种安全、有效的疫苗，该疫苗不仅编码抗原基因，还编码rna复制所需的基因并且自我复制，因此可以引起强大的免疫力。
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图1、reprna与non-reprna疫苗的构建
图2、reprna和non-reprna疫苗的体外检测
为了进一步研究细胞免疫的诱导作用，在第三次免疫后20天采集接种sars-cov-2小鼠的脾细胞，并进行elispot检测。在实验模型中，reprna疫苗的免疫水平虽然有限，但与non-reprna疫苗相比，它在小鼠体内诱导了t细胞应答(图3)。
图3、reprna和non-reprna疫苗的体内检测
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文献信息：
（1）原文链接：doi.org/10.1371/journal.pone.0274829
（2）参考文献：
1、nakamura a, kotaki t, nagai y, takazawa s, tokunaga k, et al. (2022) construction and evaluation of a self-replicative rna vaccine against sars-cov-2 using yellow fever virus replicon. plos one 17(10): e0274829.
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