干细胞和神经细胞转染利器--jetOPTIMUS之干细胞应用篇
干细胞被认为是可用于建模和修复细胞功能的强大和最灵活的细胞类型。目前干细胞被广泛用于药物筛选、细胞治疗、疾病建模、毒理学和基因组编辑研究，可以说几乎用于任何基础和转化研究领域。重要的是，其中许多技术依赖于将基因和/或蛋白质成功引入干细胞，例如crispr/cas9基因编辑。然而，干细胞，特别是多能干细胞（即能够产生任何体细胞类型的细胞）特别难以转染。转染干细胞时最大的挑战是细胞死亡，这在非病毒和病毒转染递送方法之后都有报道。此外，由于对细胞死亡的易感性和快速自我更新，干细胞的转染效率可能低于其他细胞类型。
为了利用基于化学转染进行基因操作的优势，理想的试剂需要实现高转染效率（在干细胞高于50%的情况下），同时最大限度地减少常见的干细胞细胞活力问题。
在此，本文报道了基于化学转染的转染试剂jetoptimus®在三种难转染的干细胞中的转染效率的表现：间充质干细胞（hmscs）、小鼠胚胎干细胞（mescs）和人类诱导多功能干细胞(hipscs)。jetoptimus®基于阳离子聚合物，在各种原代细胞中达到dna的高转染效率，同时对细胞活率和形态的影响最小。此外，还评估了jetoptimus对几种市售和常用的培养物和底物系统上培养hpscs的转染效率。
结果与讨论
1.jetoptimus®确保原代间充质干细胞在多次传代时具有高转染效率
图1：在用jetoptimus®转染egfp质粒24小时后，通过流式细胞术分析评估转染效率，该质粒在培养四个后续传代的原代人间充质干细胞（hmsc）中。
2.jetoptimus®在不影响小鼠胚胎干细胞生存能力的情况下实现了60%以上的转染效率
图2a：在原代mescs中用jetoptimus®转染egfp质粒24小时后，通过流式细胞术分析评估转染效率。
图2b：在原代mescs中用jetoptimus®转染egfp质粒24小时后，通过流式细胞术评估细胞活力。
3.jetoptimus®在hipsc中提供高达80%的转染效率
图3 a：用jetoptimus®在hipsc中转染egfp质粒24小时后，通过流式细胞术分析评估转染效率。
图3b：用egfp质粒转染24小时的hpscs中的gfp表达和相应的相位图像。
4.评估jetoptimus®搭配几种hipsc培养基和底物的转染效率
表1a：jetoptimus®在用几种商业干细胞培养基培养的hipsc中的转染效率从最高到低。
表1b：jetoptimus®在用几种商业干细胞基质培养的hipsc中的转染效率从最高到低。
转染方法：
质粒pcmv_egfp_luc（6.4kb）编码具有巨细胞病毒（cmv）启动子的增强型绿色荧光蛋白（egfp）/萤光素酶的融合蛋白，购自clontech（#6169-1）。质粒pef1a_egfp（4.9kb）编码具有延伸因子-1α（ef1a）启动子的egfp，购自ezyvec（#a626.1）。pcmv_egfp_luc用于转染hmsc和mes，pef1a_egfp用于转染hipsc。
转染前72小时，将hmscs接种在24孔板中，每孔12000个细胞，接种在500µl相应的细胞维持培养基中，并在37°c下用5%co2孵育。对于mescs，在转染前24小时，将细胞以每孔20000个细胞的速度接种在500µl mes培养基中的24孔板中，并在37°c下用5%co2孵育。对于hipsc，在转染前24小时，将细胞接种在涂有corning®matrigel®基质的24孔板中，该基质含有2 ml mtesr培养基和10µm rock抑制剂，每孔10万个细胞，并在37°c和5%co2下孵育。
对于hmscs和hipcs，在转染前30分钟，移除培养基并用500µl的mscbm代替™，不添加补充物，或分别用500µl含有10µm rock抑制剂的hipscs培养基，将培养板放回培养箱。
订阅信息：
货号 产品名称 规格
101000051 jetoptimus 0.1ml
101000006 jetoptimus 1.5ml
上海优宁维生物科技股份有限公司
试剂 | 耗材 | 仪器 | 软件 | 定制 | 实验服务 | 供应链
微信公众平台：优宁维抗体专家，欢迎关注！
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结果与讨论
1.jetoptimus®确保原代间充质干细胞在多次传代时具有高转染效率
图1：在用jetoptimus®转染egfp质粒24小时后，通过流式细胞术分析评估转染效率，该质粒在培养四个后续传代的原代人间充质干细胞（hmsc）中。
2.jetoptimus®在不影响小鼠胚胎干细胞生存能力的情况下实现了60%以上的转染效率
图2a：在原代mescs中用jetoptimus®转染egfp质粒24小时后，通过流式细胞术分析评估转染效率。
图2b：在原代mescs中用jetoptimus®转染egfp质粒24小时后，通过流式细胞术评估细胞活力。
3.jetoptimus®在hipsc中提供高达80%的转染效率
图3 a：用jetoptimus®在hipsc中转染egfp质粒24小时后，通过流式细胞术分析评估转染效率。
图3b：用egfp质粒转染24小时的hpscs中的gfp表达和相应的相位图像。
4.评估jetoptimus®搭配几种hipsc培养基和底物的转染效率
表1a：jetoptimus®在用几种商业干细胞培养基培养的hipsc中的转染效率从最高到低。
表1b：jetoptimus®在用几种商业干细胞基质培养的hipsc中的转染效率从最高到低。
转染方法：
质粒pcmv_egfp_luc（6.4kb）编码具有巨细胞病毒（cmv）启动子的增强型绿色荧光蛋白（egfp）/萤光素酶的融合蛋白，购自clontech（#6169-1）。质粒pef1a_egfp（4.9kb）编码具有延伸因子-1α（ef1a）启动子的egfp，购自ezyvec（#a626.1）。pcmv_egfp_luc用于转染hmsc和mes，pef1a_egfp用于转染hipsc。
转染前72小时，将hmscs接种在24孔板中，每孔12000个细胞，接种在500µl相应的细胞维持培养基中，并在37°c下用5%co2孵育。对于mescs，在转染前24小时，将细胞以每孔20000个细胞的速度接种在500µl mes培养基中的24孔板中，并在37°c下用5%co2孵育。对于hipsc，在转染前24小时，将细胞接种在涂有corning®matrigel®基质的24孔板中，该基质含有2 ml mtesr培养基和10µm rock抑制剂，每孔10万个细胞，并在37°c和5%co2下孵育。
对于hmscs和hipcs，在转染前30分钟，移除培养基并用500µl的mscbm代替™，不添加补充物，或分别用500µl含有10µm rock抑制剂的hipscs培养基，将培养板放回培养箱。
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