实验大肠杆菌的对照培养分离及菌种保存方法
大肠杆菌(escherichia coli)是分子遗传学实验、基因工程操作中广泛采用的一种受体菌，是escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物原性，尤其对婴儿和幼畜（禽），常引起严重腹泻和败血症，它是一种普通的原核生物，根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为5类：致病性大肠杆菌(epec)、肠产毒性大肠杆菌(etec)、肠侵袭性大肠杆菌(eiec)、肠出血性大肠杆菌(ehec)、肠黏附性大肠杆菌(eaec)。大肠杆菌属于细菌。它的遗传背景研究的比较详细，常用做寄主进行基因扩增及外源基因的表达。
一. 实验目的 : 掌握大肠杆菌的对照培养、单菌落的分离及菌种保存方法。
二. 实验原理 : 大肠杆菌除本身的核染色体外，往往还含有质粒(plasmid)dna，这是一种双链闭合环状的dna分子，大小在1kb-200kb左右，通常质粒dna带有利于细菌在某一特定环境下生存的酶的基因，而使寄主菌表现以下一些表现型:
1．对抗生素的抗性 2．产生抗生素 3．降解有机复合物
4．产生大肠杆菌素 5．产生内毒素 6．产生限制修饰酶
puc19质粒上带有一个与大肠杆菌抗氨苄青霉素(ampecillin)有关的基因，它能编码一种β-内酰胺酶，这种酶降解氨苄青霉素，从而消除了抗生素对细胞壁形成的抑制作用，不含这种质粒的细菌则不能在含抗生素的培养基上存活。
三．实验材料: e．coli invaf' e．coli invaf' (puc19)
四．实验仪器、器皿及试剂:仪器 : 超净工作台 恒温培养箱 高压灭菌锅 恒温水浴锅 微波炉等。器皿: (见附录)
试剂 : 琼脂 酵母抽提物 胰蛋白胨 nacl 氨苄青霉素 naoh等
五．实验步骤:
1. 配制培养基：
ａ．lb(lurib-bertani) media
酵母抽提物(yeast extract) 5g/l
胰蛋白胨 (trytone) 10g/l
nacl 10g/l
加蒸馏水定容至1000ml调节ph值至7.0。配制750ml固体培养基: 在上述液体培养基中，按15 g/l加入琼脂 加热至充分熔化，即成固体培养基。ｂ：50%的丙三醇: 取50ml丙三醇加入50mlddh2 o至100ml。将上述培养基和丙三醇溶液高温蒸汽消毒15磅20min
2. 倒平板:将固体培养基加热至充分熔化，待温度降至50℃以下凝固前，加入amp至100ug/ml摇动混匀，每平皿倒入25ml左右，此过程应进行无菌操作，另倒一不含amp的lb平板。3. 待培养基凝固以后，用接种环(灼烧消毒后)分别接种各一环贮存菌种:e.coli invaf' 和 e.coli invaf' (puc19)于不含amp的lb平板上和含amp的lb平板上,划线接种要防止划破培养基，划线方法如图所示:
第一次划线后接种环灼烧第二次划线起点与第一次 如此在平板上
再进行第二次划线 划线交*，接种环灼烧后再
进行第三次划线
4. 接种完成后将培养皿倒置入培养箱37℃培养过夜，运用这种划线方法接种，可以较好地保证单菌落的形成。5. 比较两菌系在培养基上的不同反应。挑取:e.coli invaf' e.coli invaf' (puc19)的单菌落分别接种至含amp和不含amp的5ml lb液体培养基中，37℃振荡培养过夜。6. 分别吸取0．5 ml菌液在无菌条件下，加入0．5 ml 50%丙三醇，置一灭菌的冻干管中，混匀至-20℃保存。
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一. 实验目的 : 掌握大肠杆菌的对照培养、单菌落的分离及菌种保存方法。
二. 实验原理 : 大肠杆菌除本身的核染色体外，往往还含有质粒(plasmid)dna，这是一种双链闭合环状的dna分子，大小在1kb-200kb左右，通常质粒dna带有利于细菌在某一特定环境下生存的酶的基因，而使寄主菌表现以下一些表现型:
1．对抗生素的抗性 2．产生抗生素 3．降解有机复合物
4．产生大肠杆菌素 5．产生内毒素 6．产生限制修饰酶
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三．实验材料: e．coli invaf' e．coli invaf' (puc19)
四．实验仪器、器皿及试剂:仪器 : 超净工作台 恒温培养箱 高压灭菌锅 恒温水浴锅 微波炉等。器皿: (见附录)
试剂 : 琼脂 酵母抽提物 胰蛋白胨 nacl 氨苄青霉素 naoh等
五．实验步骤:
1. 配制培养基：
ａ．lb(lurib-bertani) media
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胰蛋白胨 (trytone) 10g/l
nacl 10g/l
加蒸馏水定容至1000ml调节ph值至7.0。配制750ml固体培养基: 在上述液体培养基中，按15 g/l加入琼脂 加热至充分熔化，即成固体培养基。ｂ：50%的丙三醇: 取50ml丙三醇加入50mlddh2 o至100ml。将上述培养基和丙三醇溶液高温蒸汽消毒15磅20min
2. 倒平板:将固体培养基加热至充分熔化，待温度降至50℃以下凝固前，加入amp至100ug/ml摇动混匀，每平皿倒入25ml左右，此过程应进行无菌操作，另倒一不含amp的lb平板。3. 待培养基凝固以后，用接种环(灼烧消毒后)分别接种各一环贮存菌种:e.coli invaf' 和 e.coli invaf' (puc19)于不含amp的lb平板上和含amp的lb平板上,划线接种要防止划破培养基，划线方法如图所示:
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再进行第二次划线 划线交*，接种环灼烧后再
进行第三次划线
4. 接种完成后将培养皿倒置入培养箱37℃培养过夜，运用这种划线方法接种，可以较好地保证单菌落的形成。5. 比较两菌系在培养基上的不同反应。挑取:e.coli invaf' e.coli invaf' (puc19)的单菌落分别接种至含amp和不含amp的5ml lb液体培养基中，37℃振荡培养过夜。6. 分别吸取0．5 ml菌液在无菌条件下，加入0．5 ml 50%丙三醇，置一灭菌的冻干管中，混匀至-20℃保存。
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