重组蛋白分离纯化的基本原则
不管黑猫白猫，抓到老鼠就是好猫，对纯化来讲亦如此，能拿到纯度好的蛋白，符合纯化要求就是硬道理。不同蛋白纯化工艺不同，即使相同的原料也有不同的纯化方案。蛋白质纯化方法的选择主要是利用不同蛋白质之间的相似性与差异，依据蛋白之间的相似性可以去除非蛋白物质，在根据蛋白的差异性将目的蛋白分离出来，所以要取得好的纯化结果所可以采用的策略及原则却是共通的。
1. 针对不同的产物表达形式采用不同的策略：
a) 融合型表达重组蛋白，一般胞内可溶性的，拟选用亲和层析进行纯化；
b) 分泌型表达的重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法*行浓缩处理；
c) 包涵体型表达的重组蛋白，应先离心回收包涵体；
d) 表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的*，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。
2. 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型：
a) 离子交换法（iex）：等电点处于区域（pi≤5 或 pi≥8）的重组蛋白应选 iex 进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白。
b) 亲和层析（ac）：重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是亲和层析纯化的重要条件，原则是它们与目的蛋白之间的解离常熟应在合适的范围内（10-8—10-4mol/l）
c) 疏水（hic）和反相层析：根据蛋白质的疏水性差异进行分离的。
d) 凝胶过滤层析（gf）: 根据蛋白的分子量进行分离。
3. 每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡：
a) 分辨率：由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来完成。当杂质和目的蛋白性质相似是，在纯化的zui后阶段分辨率是选择层析方法的重要考量标准。
b) 处理量：指在纯化过程中目标蛋白的上样体积和浓度等。
c) 速度：在初纯化中是重要因素，此时杂质如蛋白酶必须尽快去除。
d) 回收率：随着纯化的进行渐趋重要，因为纯化产物的价值在增加。
4. 多种分离纯化技术联合运用：
a) 选能除去含量zui多杂质的方法；
b) 尽量选择的分离方法；
c) 将zui费时、成本zui高的分离纯化方法安排在zui后阶段。
d) 通过组合各种方法使纯化步骤之间的样品处理减至zui少，以避免需要调节样品。*个步骤的产物的洗脱条件应适宜下一个步骤的起始条件。
e) 如果对目的蛋白的性质了解甚少的情况下，可采用 iex-hic-gf 的联合运用作为标准方案。 常用层析方法的分离特点：
5. 重组蛋白分离纯化的共同参考阶段：
a) 捕获阶段：目的蛋白的澄清、浓缩和稳定。选择对目的蛋白具有zui高选择性或/和处理量的方法。
b) 中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。
c) 精纯阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。
三阶段纯化策略中每一种方法的适用性：
层析方法 主要特点 捕获 中度纯化 精纯 样品起始状态 样品zui终状态
iex 高分辨率高容量 高速度 ★★★ ★★★ ★★★ 低离子强度样品体积不限 高离子强度或ph改变样品浓缩
hic 分辨率好 容量好 高速度 ★★ ★★★ ★ 高离子强度 样品体积不限 低离子强度 样品浓缩
ac 高分辨率 高容量 高速度 ★★★ ★★★ ★★ 结合条件特殊 样品体积不限 洗脱条件特殊 样品浓缩
gf 高分辨率 （使用supedex） ★ ★★★ 样品体积（<总柱体积的5%）和流速范围有限制 缓冲液更换 样品稀释
rpc 高分辨率 ★ ★★★ 需要有机溶剂 在有机溶剂中，有损失生物活性的风险
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1. 针对不同的产物表达形式采用不同的策略：
a) 融合型表达重组蛋白，一般胞内可溶性的，拟选用亲和层析进行纯化；
b) 分泌型表达的重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法*行浓缩处理；
c) 包涵体型表达的重组蛋白，应先离心回收包涵体；
d) 表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的*，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。
2. 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型：
a) 离子交换法（iex）：等电点处于区域（pi≤5 或 pi≥8）的重组蛋白应选 iex 进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白。
b) 亲和层析（ac）：重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是亲和层析纯化的重要条件，原则是它们与目的蛋白之间的解离常熟应在合适的范围内（10-8—10-4mol/l）
c) 疏水（hic）和反相层析：根据蛋白质的疏水性差异进行分离的。
d) 凝胶过滤层析（gf）: 根据蛋白的分子量进行分离。
3. 每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡：
a) 分辨率：由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来完成。当杂质和目的蛋白性质相似是，在纯化的zui后阶段分辨率是选择层析方法的重要考量标准。
b) 处理量：指在纯化过程中目标蛋白的上样体积和浓度等。
c) 速度：在初纯化中是重要因素，此时杂质如蛋白酶必须尽快去除。
d) 回收率：随着纯化的进行渐趋重要，因为纯化产物的价值在增加。
4. 多种分离纯化技术联合运用：
a) 选能除去含量zui多杂质的方法；
b) 尽量选择的分离方法；
c) 将zui费时、成本zui高的分离纯化方法安排在zui后阶段。
d) 通过组合各种方法使纯化步骤之间的样品处理减至zui少，以避免需要调节样品。*个步骤的产物的洗脱条件应适宜下一个步骤的起始条件。
e) 如果对目的蛋白的性质了解甚少的情况下，可采用 iex-hic-gf 的联合运用作为标准方案。 常用层析方法的分离特点：
5. 重组蛋白分离纯化的共同参考阶段：
a) 捕获阶段：目的蛋白的澄清、浓缩和稳定。选择对目的蛋白具有zui高选择性或/和处理量的方法。
b) 中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。
c) 精纯阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。
三阶段纯化策略中每一种方法的适用性：
层析方法 主要特点 捕获 中度纯化 精纯 样品起始状态 样品zui终状态
iex 高分辨率高容量 高速度 ★★★ ★★★ ★★★ 低离子强度样品体积不限 高离子强度或ph改变样品浓缩
hic 分辨率好 容量好 高速度 ★★ ★★★ ★ 高离子强度 样品体积不限 低离子强度 样品浓缩
ac 高分辨率 高容量 高速度 ★★★ ★★★ ★★ 结合条件特殊 样品体积不限 洗脱条件特殊 样品浓缩
gf 高分辨率 （使用supedex） ★ ★★★ 样品体积（<总柱体积的5%）和流速范围有限制 缓冲液更换 样品稀释
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