PCR实验循环步骤分述
聚合酶链反应(pcr)技术是在体外进行的由引物介导的酶促dna扩增反应。pcr的原理是在模板dna、pcr引物、四种脱氧核糖核苷酸(dntp)及适当浓度的mg2+存在的条件下，依赖于dna聚合酶的体外酶促合成反应。根据pcr使用说明进行试剂混合预配，并设置 pcr 循环。简而言之，pcr需要经过以下循环：
1.初始化步骤
这仅对热启动 pcr 必不ke少。此步骤将溶液加热至 94-98°c，以激活 dna 聚合酶。该步骤的时间取决于所使用的聚合酶。
2.变性步骤
dna是双链分子，dna扩增需要引物与单链dna模板相互作用。在此步骤中，将反应混合物加热至 94-98°c 并保持 20-30 秒，以破坏两条链之间的氢键并生成单链 dna 分子。此时进入 pcr 循环。
3.退火步骤
变性后，反应混合物中的 dna 模板是单链的。由于引物与dna模板互补，当反应温度降低到50-65℃时，引物会与模板序列匹配，互补碱基之间形成氢键。退火温度取决于所用引物的tm，一般比引物tm低3-5℃左右。该步骤将持续约 20-40 秒以wan全退火，然后聚合酶将定位到引物-模板杂交体以开始 dna 组装。
4.伸长步骤
在此步骤中，dna 聚合酶开始合成 dna，因此温度应为 dna 聚合酶的最适温度。一般选择 72°c，但有些酶在 68°c 时效果更好。这一步与体内dna复制非常相似，dna聚合酶将dntps添加到引物中，以5'到3'方向与模板互补，最终产生新的双链dna片段。延伸时间取决于目标 dna 片段的长度和 dna 聚合酶的能力。一般来说，dna 聚合酶每 60 秒产生一千个碱基。
5. 2~4步称为一个循环，每循环一次，目标片段量翻倍。一个 pcr 过程使用 30-35 个循环。在 pcr 循环的早期，pcr 产物以指数速率积累，而在 pcr 循环的后期，随着 dntps、引物的减少和 dna 聚合酶在变性温度下的失活，反应减慢，pcr 速率逐渐下降。
6.最终伸长率。30-35个循环结束后，在68-74℃的温度下最终延伸约5-10分钟，以充分延伸剩余的单链dna。
7.贮存。最终产品可以在 pcr 机器中维持温度在 4-10°c。
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