GB 5009.8-2023 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定
中华人民共和国国家标准
gb 5009.8-2023
食品安全国家标准
食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定
前言
本标准代替gb 5009.8-2016《食品安全国家标准食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》和gb5413.5-2010《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中乳糖、蔗糖的测定》。
本标准与gb 5009.8-2016相比，主要变化如下：
——修改了第一法高效液相色谱法的适用范围；
——增加了离子色谱法为第二法；
——修改了酸水解-莱因-埃农氏法为第三法；
——增加了莱因-埃农氏法为第四法。
1范围
本标准规定了食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定方法。
第一法高效液相色谱法，适用于粮食及粮食制品、乳及乳制品、果蔬及果蔬制品、甜味料、糖果、饮料和婴幼儿食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定。
第二法离子色谱法，适用于食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定。
第三法酸水解-莱因埃农氏法，适用于食品中蔗糖的测定。
第四法莱因-埃农氏法，适用于婴幼儿食品和乳品中乳糖的测定。
第一法高效液相色谱法
2原理
试样中的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖经提取后，高效液相色谱柱分离，示差折光检测器或蒸发光散射检测器检测，外标法定量。
3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为gb/t6682规定的一级水。
3.1试剂
3.1.1乙腈(c2h3n)：色谱纯。
3.1.2乙酸锌[zn(ch3coo)2·2h2o]。
3.1.3亚铁氰化钾[k4fe(cn)6·3h2o]。
3.1.4冰乙酸(ch3cooh)。
3.2试剂配制
3.2.1乙酸锌溶液(1 mol/l)：称取乙酸锌21.9 g，加入3 ml冰乙酸，溶于水并稀释至100 ml，混匀。
3.2.2亚铁氰化钾溶液(0.25 mol/l)：称取亚铁氰化钾10.6 g，溶于水并稀释至100 ml，混匀。
3.3标准品
3.3.1果糖(c6h12o6，cas号：57-48-7)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.2葡萄糖(c6h12o6，cas号：50-99-7)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.3蔗糖(c12h22o11，cas号：57-50-1)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.4麦芽糖(c12h22o11，cas号：69-79-4)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3..3.5乳糖(c12h22o11，cas号：63-42-3)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.4标准溶液配制
3.4.1混合标准储备液(20.0 mg/ml)：分别称取经过90℃±2℃干燥2 h的果糖和96℃±2℃干燥2 h的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖各1 g(精确至0.001 g)，用水溶解后转移至50 ml容量瓶中，加入2.5 ml乙腈，用水定容至刻度。置于0℃~4℃密封，保存期3个月。
3.4.2混合标准工作液：吸取0.100 ml、1.00 ml、2.00 ml、3.00 ml和5.00 ml混合标准储备液(20.0mg/ml)于10.0ml容量瓶中，用水定容至刻度，配得果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的质量浓度为0.200 mg/ml、2.00 mg/ml、4.00 mg/ml、6.00 mg/ml和10.0 mg/ml的混合标准工作液，可根据实际样品溶液的浓度适当调整混合标准工作液浓度。临用现配。
3.5材料
3.5.1 0.45μm水性滤膜针头过滤器(纤维素滤膜除外)。
3.5.2注射器。
4仪器和设备
4.1高效液相色谱仪：配示差折光检测器或蒸发光散射检测器。
4.2分析天平：感量为1 mg和10 mg。
4.3旋涡混合器。
4.4离心机：转速≥4000 r/ min。
4.5超声波清洗器。
4.6样品粉碎设备：高速粉碎机。
4.7恒温干燥箱。
4.8恒温水浴装置。
5分析步骤
5.1样品前处理
5.1.1试样制备
取适量有代表性的样品，饮料等液态均匀样品直接摇匀；非均匀的样品需匀浆或粉碎均匀；冷冻饮品室温融化后充分搅拌均匀，必要时可采用30℃~40℃水浴加热搅拌；巧克力采用50℃~60℃水浴加热熔融，并趁热充分搅拌均匀。
5.1.2试样提取
5.1.2.1胶基糖果和巧克力等难溶解试样
称取试样2 g(精确至0.001 g)于100 ml比色管中，加入约50 ml 50℃~60℃热水，涡旋或搅拌，待样品充分溶解，再缓慢加入5 ml乙酸锌溶液和5 ml亚铁氰化钾溶液，涡旋混匀，超声30 min，转移至100 ml容量瓶中并用水定容至刻度，混匀，静置。
5.1.2.2含气体和酒精试样
称取混匀后的试样50 g(精确至0.01 g)于蒸发皿中，在水浴上微热搅拌去除气体和酒精，待冷却后移至100 ml容量瓶中，缓慢加入5 ml乙酸锌溶液和5 ml亚铁氰化钾溶液，用水定容至刻度，混匀，静置。
5.1.2.3糖浆和蜂蜜类试样
称取混匀后的试样1 g~2g(精确至0.001 g)于100 ml比色管中，加入约50 ml水，涡旋混匀至充分溶解，转移至100 ml容量瓶中并用水定容至刻度，混匀，静置。
5.1.2.4其他试样
称取粉碎或混匀后的试样1 g~10 g(精确至0.001 g)(目标糖含量≤5%时称取10 g；含量5%~
10%时称取5 g；含量10%~40%时称取2 g；含量≥40%时称取1 g)至100 ml比色管中，加入约50 ml水，再缓慢加入5 ml乙酸锌溶液和5 ml亚铁氰化钾溶液，涡旋混匀，超声30 min，转移至100 ml容量瓶中并用水定容至刻度，混匀，静置。
5.1.3净化
上述试样提取液用滤纸过滤(弃去初滤液)或离心获取上清液后，用0.45μm水性滤膜针头过滤器过滤至样品瓶，供高效液相色谱仪分析。
5.2仪器参考条件
仪器参考条件如下：
a)色谱柱：氨基色谱柱(4.6 mm×250 mm，粒径5μm，氨基硅烷键合硅胶为填充剂)，或性能相当者；
b)流动相：乙腈+水=70+ 30(体积比)；
c)流速：1.0 ml/ min；
d)柱温：40℃；
e)进样量：10μl；
f)示差折光检测器条件；温度40℃；
g)蒸发光散射检测器条件：飘移管温度80℃~90℃；氮气流速2.5 l/min。
5.3标准曲线的制作
将混合标准工作液按浓度从低到高依次注入高效液相色谱仪，测定果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖相应的峰面积或峰高。示差折光检测器以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积或峰高为纵坐标绘制标准曲线；蒸发光散射检测器以标准工作液浓度的幂函数为横坐标，以峰面积或峰高的幂函数为纵坐标绘制标准曲线。果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖标准溶液的高效液相色谱图参见附录a。
5.4试样溶液的测定
将试样溶液注入高效液相色谱仪中，根据保留时间定性，记录目标物的峰面积或峰高，根据标准曲线得到试样溶液中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的浓度。
5.5空白试验
除不加试样外，均按上述步骤进行。
6分析结果的表述
试样中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的含量按公式(1)计算。
式中：
x——试样中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的含量，单位为克每百克(g/100 g)；
ρ——根据标准曲线得到的试样溶液中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的质量浓度，单位为毫克每毫升(mg/ ml)；
ρ0——根据标准曲线得到的空白中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的质量浓度，单位为毫克每毫升(mg/ml)；
v——定容体积，单位为毫升( ml)；
f——稀释倍数；
n——试样的称样量，单位为克(g)；
1 000——换算系数；
100——换算系数。
糖的含量≥10 g/100 g时，计算结果保留3位有效数字；糖的含量<10 g/100 g时，计算结果保留2位有效数字。
7精密度
在重复条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
8其他
当称样量为10 g、定容体积为100 ml时，果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的方法检出限均为0.2 g/100 g，定量限均为0.5 g/100 g。
第二法离子色谱法
9原理
试样中的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖经提取净化后，离子色谱柱分离，脉冲安培检测器检测，外标法定量。
10试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为gb/t 6682规定的一级水。
10.1试剂
10.1.1氢氧化钠(naoh)：色谱纯。
10.1.2冰乙酸(ch3cooh)。
10.2试剂配制
10.2.1氢氧化钠溶液(200 mmol/l)：称取8.00 g氢氧化钠，溶于水并稀释至1 000 ml，混匀。
10.2.2乙酸溶液(3%，体积分数)：量取3 ml冰乙酸，用水稀释至100 ml，混匀。
10.3标准品
10.3.1果糖(c6h12o6，cas号：57-48-7)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
10.3.2葡萄糖(c6h12o6，cas号：50-99-7)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
10.3.3蔗糖(c12h22o11，cas号：57-50-1)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
10.3.4麦芽糖(c12h22o11，cas号：69-79-4)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
10.3.5乳糖(c12h22o11，cas号：63-42-3)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
10.4标准溶液的制备
10.4.1混合标准储备液(10.0 mg/ml)：分别称取经过90℃±2℃干燥2 h的果糖和96℃±2℃干燥2h的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖各1 g(精确至0.001 g)，加水溶解后转移至100 ml容量瓶中，加入2 ml乙酸溶液，并用水定容至刻度。置于0℃~4℃密封，保存期3个月。
10.4.2混合标准中间液(100 mg/l)：吸取1.00 ml果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖混合标准储备液(10.0 mg/ml)于100 ml容量瓶中，用水定容至刻度。置于0℃~4℃密封，保存期1个月。
10.4.3混合标准工作液：分别吸取0.250 ml、0.500 ml.1.00 ml、2.00 ml和2.50 ml混合标准中间液(100mg/l)于10ml容量瓶中，用水定容至刻度，配得果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的质量浓度为2.50 mg/l、5.00 mg/l、10.0 mg/l、20.0 mg/l和25.0 mg/l的混合标准工作液，可根据实际样品溶液的浓度适当调整混合标准工作液浓度。临用现配。
10.5材料
10.5.1 0.45μm水性滤膜针头过滤器(纤维素滤膜除外)。
10.5.2净化柱：c18固相萃取小柱(1.0 ml)或性能相当者。
10.5.3注射器。
11仪器和设备
11.1离子色谱仪：配脉冲安培检测器。
11.2样品粉碎设备：高速粉碎机。
11.3超声波清洗器。
11.4分析天平：感量为1 mg。
11.5旋涡混合器。
11.6离心机：转速≥4 000 r/ min。
11.7恒温干燥箱。
11.8恒温水浴装置。
12试验步骤
12.1样品前处理
12.1.1试样制备
取适量有代表性的样品，饮料等液态均匀样品直接摇匀；非均匀的样品需匀浆或粉碎均匀；冷冻饮品室温融化后充分搅拌均匀，必要时可采用30℃~40℃水浴加热搅拌；酱类等可以采用研磨或者均质混匀；巧克力采用50℃~60℃水浴中加热熔融，并趁热充分搅拌均匀。
12.1.2试样提取
12.1.2.1胶基糖果和巧克力等难溶解试样
准确称取试样2 g(精确至0.001 g)于100 ml比色管中，加入约50 ml 50℃~60℃热水，涡旋或搅拌，待样品充分溶解，加入2 ml乙酸溶液，涡旋混匀，超声30 min，转移至100 ml容量瓶中并用水定容至刻度，混匀，静置20 min。
12.1.2.2糖浆和蜂蜜类试样
称取混匀后的试样2 g(精确至0.001 g)于100 ml比色管中，加入约50 ml水，涡旋混匀至充分溶解，转移至100 ml容量瓶中并用水定容至刻度，混匀，静置20 min。
12.1.2.3含气体和酒精试样
准确称取试样10 g(精确至0.001 g)于蒸发皿中，在水浴上微热搅拌去除气体和酒精，待冷却后用水移至100 ml容量瓶中，加入2 ml乙酸溶液，用水定容至刻度，混匀，静置20 min。
12.1.2.4其他试样
称取固体试样2 g(精确至0.001 g)，半固态或液态试样5 g~10 g(精确至0.001 g)于100 ml比色管中，加入约50 ml水，涡旋混匀，再加入2 ml乙酸溶液混匀后，超声30 min，转移至100 ml容量瓶中并用水定容至刻度，混匀，静置20 min。
12.1.3试样净化
试样提取溶液可根据试样中目标糖含量稀释适当的倍数，婴幼儿配方乳粉中的乳糖检测时，稀释1000倍后净化；蜂蜜和糖果中高含量糖检测时，稀释500倍后净化。
上述试样提取溶液或稀释溶液采用滤纸过滤或离心获取上清液后，依次过0.45μm水性滤膜针头过滤器和c18固相萃取小柱(1.0 ml)，弃去前3 ml，收集后续的洗脱液待测。
c18固相萃取小柱(1.0 ml)使用前依次用10 ml甲醇、15 ml水通过，静置活化30 min。
12.2仪器参考条件
仪器参考条件如下：
a)色谱柱：阴离子交换柱(4 mm×250 mm，粒径10μm，以季铵盐为功能基，聚苯乙烯/二乙烯基苯聚合物树脂作为填料)(带保护柱4 mm×50 mm)，或性能相当者；
b)流速：1.0 ml/min；
c)进样量：10μl；
d)脉冲安培检测器：au工作电极；糖检测波形参考条件见表1；
e)淋洗液：淋洗液a：水；淋洗液b：氢氧化钠溶液(200 mmol/l)；洗脱参考条件见表2。
12.3标准工作曲线绘制
将混合标准工作液按浓度从低到高依次注入离子色谱仪，测定果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖相应的峰面积，以标准工作液中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，分别绘制标准曲线。果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖标准溶液的离子色谱图参见附录b。
12.4试样溶液的测定
将试样溶液注入离子色谱仪中，根据保留时间定性，记录峰面积，根据标准曲线得到试样溶液中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的浓度。
12.5空白试验
除不加试样外，均按上述步骤进行。
13分析结果的表述
试样中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的含量按公式(2)计算。
式中：
x——试样中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的含量，单位为克每百克(g/100 g)；
ρ——由标准曲线计算得到的试样溶液中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的质量浓度，单位为毫克每升(mg/l)；
ρ0——由标准曲线计算得到的空白中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的质量浓度，单位为毫克每升(mg/l)；
v——定容的体积，单位为毫升(ml)；
f——稀释倍数；
m——试样的称样量，单位为克(g)；
1000——换算系数；
10——换算系数。
糖的含量≥10 g/100 g时，计算结果保留3位有效数字；糖的含量<10 g/100 g时，计算结果保留2位有效数字。
14精密度
在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
15其他
当称样量为2 g、定容体积为100 ml时，果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的方法检出限均为0.015 g/100 g，定量限均为0.050 g/100 g。
第三法酸水解-莱因-埃农氏法
16原理
试样除去蛋白质后，其中蔗糖经盐酸水解转化为还原糖，按还原糖测定，水解前后的差值乘以相应的系数即为蔗糖含量。棉子糖、水苏糖、低聚半乳糖、果聚糖、聚葡萄糖和抗性糊精等会对蔗糖的测定产生干扰。
17试剂和溶液
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为gb/t6682规定的三级水。
17.1试剂
17.1.1乙酸锌[zn(ch3coo)2·2h2o]。
17.1.2亚铁氰化钾[k4fe(cn)6·3h2o]。
17.1.3盐酸(hci)。
17.1.4氢氧化钠(naoh)。
17.1.5甲基红(c15h15n3o2)：指示剂。
17.1.6亚甲基蓝(c16h18cln3s·3h2o)：指示剂。
17.1.7硫酸铜(cuso4·5h2o)。
17.1.8酒石酸钾钠(c4h4o6kna·4h2o)。
17.1.9冰乙酸(ch3cooh)。
17.1.10乙醇(c2h5oh)：95%。
17.2试剂配制
17.2.1乙酸锌溶液(1 mol/l)：称取乙酸锌21.9 g，加3 ml冰乙酸，溶于水并稀释至100 ml，混匀。
17.2.2亚铁氰化钾溶液(0.25 mol/l)：称取亚铁氰化钾10.6 g，溶于水并稀释至100 ml，混匀。
17.2.3盐酸溶液(50%，体积分数)：量取盐酸50 ml，缓慢加入50 ml水中，冷却后混匀。
17.2.4氢氧化钠溶液(40 g/l)：称取氢氧化钠4.0 g，加水溶解后，冷却，用水稀释至100 ml，混匀。
17.2.5甲基红指示液(1 g/l)：称取甲基红0.1 g，用95%乙醇溶解并稀释至100 ml，混匀。
17.2.6氢氧化钠溶液(200 g/l)：称取氢氧化钠20.0 g，加水溶解后，冷却，用水稀释至100 ml，混匀。
17.2.7碱性酒石酸铜甲液：称取硫酸铜15.0 g和亚甲基蓝0.05 g，溶于水并稀释至1 000 ml，混匀。
17.2.8碱性酒石酸铜乙液：称取酒石酸钾钠50.0 g和氢氧化钠75.0 g，溶于水中，再加入亚铁氰化钾4.0g，完全溶解后，用水稀释至1000ml，混匀，储存于橡胶塞玻璃瓶中。
17.3标准品
葡萄糖(c6h12o6，cas号：50-99-7)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
17.4标准溶液配制
葡萄糖标准溶液(1.00 mg/ml)：称取经过96℃±2℃烘箱中干燥2h的葡萄糖1 g(精确至0.001 g)，加水溶解后转移至1000ml的容量瓶中，加入5ml盐酸，并用水定容至刻度。置于0℃~4℃密封保存。
18仪器和设备
18.1分析天平：感量为1 mg和10 mg。
18.2恒温水浴装置。
18.3可调温电炉。
18.4酸式滴定管：25 ml。
18.5样品粉碎设备：高速粉碎机。
18.6恒温干燥箱。
19分析步骤
19.1样品前处理
19.1.1试样制备
取适量有代表性的样品，饮料等液态均匀样品直接摇匀；非均匀的样品需匀浆或粉碎均匀；冷冻饮品室温融化后充分搅拌均匀，必要时可采用30℃~40℃水浴加热搅拌；酱类等可以采用研磨或者均质混匀；巧克力采用50℃~60℃水浴中加热熔融，并趁热充分搅拌均匀。
19.1.2试样处理
19.1.2.1胶基糖果和巧克力等难溶解试样
称取试样2.5 g~5 g(精确至0.001 g)于100 ml烧杯中，加入约50 ml 50℃~60℃热水搅拌溶
解，再缓慢加入5 ml乙酸锌溶液和5 ml亚铁氰化钾溶液，混匀，放冷，转移至250 ml容量瓶中并用水定容至刻度，混匀，静置30 min，用滤纸过滤，弃去初滤液，取后续滤液备用。
19.1.2.2含淀粉试样
称取粉碎或混匀后的试样10g~20 g(精确至0.001 g)，置于烧杯中，加入约200 ml水，在45℃水浴中加热1 h，并振摇，冷却后转移至250 ml容量瓶中并定容，混匀，静置，沉淀。吸取200 ml上清液于另一250 ml容量瓶中，缓慢加入5 ml乙酸锌溶液和5 ml亚铁氰化钾溶液，用水定容至刻度，混匀，静置30min，用滤纸过滤，弃去初滤液，取后续滤液备用。
19.1.2.3含气体和酒精试样
称取混匀后的试样100 g(精确至0.01 g)，置于蒸发皿中，用氢氧化钠溶液(40 g/l)中和至中性，在水浴上微热搅拌去除气体和酒精，待冷却后移至250 ml容量瓶中，缓慢加入5 ml乙酸锌溶液和5 ml亚铁氰化钾溶液，用水定容至刻度，混匀，静置30min，用滤纸过滤，弃去初滤液，取后续滤液备用。
19.1.2.4其他试样
称取粉碎或混匀后的固体试样2.5g~5 g(精确至0.001 g)或液体试样5 g~25 g(精确至0.001 g)，
置于烧杯中，加入约50 ml水，缓慢加入5 ml乙酸锌溶液和5 ml亚铁氰化钾溶液，搅拌混匀转移至250 ml容量瓶中并用水定容至刻度，混匀，静置30 min，用滤纸过滤，弃去初滤液，取后续滤液备用。
19.2酸水解
吸取2份试样处理液各50.0 ml，分别置于100 ml容量瓶中。
19.2.1转化前：1份用水定容至刻度，混匀。
19.2.2转化后：1份加5 ml盐酸溶液，在68℃~70℃水浴中加热15 min，冷却后加2滴甲基红指示液，用氢氧化钠溶液(200 g/l)中和至中性，用水定容至刻度，混匀。
19.3标定碱性酒石酸铜溶液
吸取5.0 ml碱性酒石酸铜甲液和5.0 ml碱性酒石酸铜乙液于150 ml锥形瓶中，加入10 ml水，加2粒~4粒玻璃珠，从滴定管中加约9 ml葡萄糖标准溶液，控制在2 min内加热至沸，趁热以1滴/2 s的速度滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪尽为终点，记录消耗葡萄糖标准溶液总体积，同时平行操作3份，取其平均值，计算每10 ml碱性酒石酸铜溶液(碱性酒石酸甲、乙液各5 ml)相当于葡萄糖的质量a(mg)。
注：也可以按上述方法标定4ml~20ml碱性酒石酸铜溶液(甲、乙液各半)来适应试样中还原糖的浓度变化。
19.4试样溶液的测定
19.4.1预测滴定：吸取5.0 ml碱性酒石酸铜甲液和5.0 ml碱性酒石酸铜乙液于150 ml锥形瓶中，加入10 ml蒸馏水，加2粒~4粒玻璃珠，置于电炉.上加热，使其在2 min内沸腾，保持沸腾状态15 s，滴入转化前样液(19.2.1)或转化后样液(19.2.2)至溶液蓝色刚好褪尽为终点，读取所用样液的体积。
19.4.2精确滴定：吸取5.0 ml碱性酒石酸铜甲液和5.0 ml碱性酒石酸铜乙液于150 ml锥形瓶中，加入10ml蒸馏水，加2粒~4粒玻璃珠，从滴定管中放出比预测滴定(19.4.1)预测体积少1ml的样液，置于电炉上，使其在2min内沸腾，维持沸腾状态2min，以1滴/2s的速度徐徐滴入样液，至溶液蓝色刚好褪尽为终点，记录样液消耗的体积(v)。
注：当样液还原糖浓度过低时，可以采用反滴定的方式进行测定。吸取5.00 ml碱性酒石酸铜甲液及5.00 ml碱性酒石酸铜乙液至锥形瓶中，直接加入10.0 ml样液，免去加水10 ml，再用葡萄糖标准溶液滴定至终点，记录消耗的体积。消耗体积与标定时消耗的葡萄糖标准溶液体积之差相当于10 ml样液中所含葡萄糖的量a1(mg)。
20分析结果的表述
20.1还原糖的含量
试样中还原糖(以葡萄糖计)的含量按公式(3)计算。
式中：
r——试样中还原糖(以葡萄糖计)的质量分数，单位为克每百克(g/100 g)；
a——碱性酒石酸铜溶液(甲、乙液各半)相当于葡萄糖的质量，单位为毫克(mg)；
m——试样的称样量，单位为克(g)；
50——酸水解(19.2)中吸取样液体积，单位为毫升(ml)；
250——试样处理(19.1)中定容体积，单位为毫升(ml)；
v——滴定时消耗样液体积，单位为毫升(ml)；
100——酸水解(19.2)中定容体积，单位为毫升(ml)；
1 000——换算系数；
f——当使用19.1.2.2步骤时，f= 1.25；其他步骤时，f=1；
100——换算系数。
采用反滴定方式测定时，试样中还原糖(以葡萄糖计)的含量按公式(4)计算。
式中：
r——试样中还原糖(以葡萄糖计)的质量分数，单位为克每百克(g/100 g)；
a1——标定10ml碱性酒石酸铜溶液(甲、乙液各半)时消耗的葡萄糖标准溶液的体积与加入
10ml样液后消耗的葡萄糖标准溶液体积之差相当于葡萄糖的质量，单位为毫克(mg)；
m——试样的称样量，单位为克(g)；
50——酸水解(19.2)中吸取样液体积，单位为毫升(ml)；
250——试样处理(19.1)中定容体积，单位为毫升(ml)；
10——直接加入的样液体积，单位为毫升(ml)；
100——酸水解(19.2)中定容体积，单位为毫升(ml)；
1 000——换算系数；
f——当使用19.1.2.2步骤时，f=1.25；其他步骤时，f=1；
100——换算系数。
20.2蔗糖的含量
试样中蔗糖的含量按公式(5)计算。
式中：
x——试样中蔗糖的质量分数，单位为克每百克(g/100 g)；
r2——转化后还原糖(以葡萄糖计)的质量分数，单位为克每百克(g/100g)；
r1——转化前还原糖(以葡萄糖计)的质量分数，单位为克每百克(g/100g)；
0.95——还原糖(以葡萄糖计)换算为蔗糖的系数。
蔗糖含量≥10 g/100g时，计算结果保留3位有效数字；蔗糖含量<10 g/100 g时，计算结果保留2位有效数字。
21精密度
在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
第四法莱因-埃农氏法
22原理
试样除去蛋白质后，在加热条件下，以亚甲基蓝为指示剂，直接滴定已标定过的费林氏液，根据样液消耗的体积，计算乳糖含量。果糖、葡萄糖、麦芽糖和低聚半乳糖等会对乳糖的测定产生干扰。
23试剂和材料
除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为gb/t 6682规定的三级水。
23.1试剂
23.1.1乙酸铅[pb(ch3coo)2·3h2o]。
23.1.2草酸钾(k2c2o4·h2o)。
23.1.3磷酸氢二钠(na2hpo4)。
23.1.4硫酸铜(cuso4·5h2o)。
23.1.5浓硫酸(h2so4)：98%。
23.1.6酒石酸钾钠(c4h4o6kna·4h2o)。
23.1.7氢氧化钠(naoh)。
23.1.8亚甲基蓝(c16 h18cln3s·3h2o)：指示剂。
23.2试剂配制
23.2.1乙酸铅溶液(200 g/l)：称取200 g乙酸铅，用水稀释至1 000 ml，混匀。
23.2.2草酸钾-磷酸氢二钠溶液：称取草酸钾30 g，磷酸氢二钠70 g，用水稀释至1 000 ml，混匀。
23.2.3亚甲基蓝溶液(10 g/l)：称取1 g亚甲基蓝于100 ml水中，混匀。
23.2.4费林氏液(甲液和乙液)
23.2.4.1甲液：称取34.639 g硫酸铜，溶于水中，加入0.5 ml浓硫酸，加水至500 ml，混匀。
23.2.4.2乙液：称取173 g酒石酸钾钠及50 g氢氧化钠溶解于水中，稀释至500 ml，混匀，静置2 d后过滤。
23.3标准品
23.3.1乳糖(c12h22o11，cas号：63-42-3)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
24仪器和设备
24.1天平：感量为0.1 mg。
24.2可调温电炉。
24.3酸式滴定管：50 ml。
24.4恒温干燥箱。
25分析步骤
25.1费林氏液的标定
25.1.1称取经过96℃±2℃烘箱中干燥2 h的乳糖约0.75 g(精确至0.1 mg)，用水溶解并定容至250 ml。将此乳糖溶液注入一个50 ml滴定管中，待滴定。
25.1.2预测滴定：吸取10 ml费林氏液(甲、乙液各5 ml)于250 ml三角烧瓶中。加入20 ml蒸馏水，放入几粒玻璃珠，从滴定管中放出15 ml样液于三角瓶中，置于电炉上加热，使其在2 min内沸腾，保持沸腾状态15s，加入3滴亚甲基蓝溶液，继续滴入样液至溶液蓝色完全褪尽为止，读取所用样液的体积。
25.1.3精确滴定：另取10 ml费林氏液(甲、乙液各5 ml)于250 ml三角烧瓶中，再加入20 ml蒸馏水，放入几粒玻璃珠，加入比预滴定量少0.5 ml~1.0 ml的样液，置于电炉上，使其在2 min内沸腾，维持沸腾状态2 min，加入3滴亚甲基蓝溶液，以1滴/2s的速度徐徐滴入样液，溶液蓝色完全褪尽即为终点，记录消耗样液的体积。
25.1.4费林氏液的乳糖校正值(f )按公式(6)和公式(7)计算。
式中：
a——实测乳糖数，单位为毫克(mg)；
v1——滴定时消耗乳糖溶液的体积，单位为毫升(ml)；
m1——称取乳糖的质量，单位为克(g)；
f——费林氏液的乳糖校正值；
al——由乳糖溶液滴定毫升数查表3所得的乳糖数，单位为毫克(mg)。
25.2乳糖的测定
25.2.1试样处理
称取婴幼儿食品或脱脂粉2 g、全脂加糖粉或全脂粉2.5g、乳清粉1 g，精确至0.1 mg，置于烧杯中，用约100 ml水溶解并分数次洗入250 ml容量瓶中，徐徐加入4 ml乙酸铅溶液和4 ml草酸钾-磷酸氢二钠溶液，并摇动容量瓶，用水定容至刻度，混匀，静置数分钟，用干燥滤纸过滤，弃去最初25 ml滤液，取后续滤液待滴定。
25.2.2滴定
25.2.2.1预测滴定：操作同25.1.2。
25.2.2.2精确滴定：操作同25.1.3。
26分析结果的表述
试样中乳糖的含量x按公式(8)计算。
式中：
x——试样中乳糖的质量分数，单位为克每百克(g/100 g)；
f——由消耗样液的毫升数查表3所得乳糖数，单位为毫克( mg)；
f——费林氏液乳糖校正值；
v——滴定消耗样液量，单位为毫升(ml)；
m——试样的质量，单位为克(g)。
结果保留3位有效数字。
注：若试样中蔗糖与乳糖之比超过3：1时，则计算乳糖时应在滴定量中加上表4中的校正值数后再查表3。
27精密度
在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的1.5%。
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gb 5009.8-2023
食品安全国家标准
食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定
前言
本标准代替gb 5009.8-2016《食品安全国家标准食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》和gb5413.5-2010《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中乳糖、蔗糖的测定》。
本标准与gb 5009.8-2016相比，主要变化如下：
——修改了第一法高效液相色谱法的适用范围；
——增加了离子色谱法为第二法；
——修改了酸水解-莱因-埃农氏法为第三法；
——增加了莱因-埃农氏法为第四法。
1范围
本标准规定了食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定方法。
第一法高效液相色谱法，适用于粮食及粮食制品、乳及乳制品、果蔬及果蔬制品、甜味料、糖果、饮料和婴幼儿食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定。
第二法离子色谱法，适用于食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定。
第三法酸水解-莱因埃农氏法，适用于食品中蔗糖的测定。
第四法莱因-埃农氏法，适用于婴幼儿食品和乳品中乳糖的测定。
第一法高效液相色谱法
2原理
试样中的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖经提取后，高效液相色谱柱分离，示差折光检测器或蒸发光散射检测器检测，外标法定量。
3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为gb/t6682规定的一级水。
3.1试剂
3.1.1乙腈(c2h3n)：色谱纯。
3.1.2乙酸锌[zn(ch3coo)2·2h2o]。
3.1.3亚铁氰化钾[k4fe(cn)6·3h2o]。
3.1.4冰乙酸(ch3cooh)。
3.2试剂配制
3.2.1乙酸锌溶液(1 mol/l)：称取乙酸锌21.9 g，加入3 ml冰乙酸，溶于水并稀释至100 ml，混匀。
3.2.2亚铁氰化钾溶液(0.25 mol/l)：称取亚铁氰化钾10.6 g，溶于水并稀释至100 ml，混匀。
3.3标准品
3.3.1果糖(c6h12o6，cas号：57-48-7)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.2葡萄糖(c6h12o6，cas号：50-99-7)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.3蔗糖(c12h22o11，cas号：57-50-1)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.4麦芽糖(c12h22o11，cas号：69-79-4)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3..3.5乳糖(c12h22o11，cas号：63-42-3)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.4标准溶液配制
3.4.1混合标准储备液(20.0 mg/ml)：分别称取经过90℃±2℃干燥2 h的果糖和96℃±2℃干燥2 h的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖各1 g(精确至0.001 g)，用水溶解后转移至50 ml容量瓶中，加入2.5 ml乙腈，用水定容至刻度。置于0℃~4℃密封，保存期3个月。
3.4.2混合标准工作液：吸取0.100 ml、1.00 ml、2.00 ml、3.00 ml和5.00 ml混合标准储备液(20.0mg/ml)于10.0ml容量瓶中，用水定容至刻度，配得果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的质量浓度为0.200 mg/ml、2.00 mg/ml、4.00 mg/ml、6.00 mg/ml和10.0 mg/ml的混合标准工作液，可根据实际样品溶液的浓度适当调整混合标准工作液浓度。临用现配。
3.5材料
3.5.1 0.45μm水性滤膜针头过滤器(纤维素滤膜除外)。
3.5.2注射器。
4仪器和设备
4.1高效液相色谱仪：配示差折光检测器或蒸发光散射检测器。
4.2分析天平：感量为1 mg和10 mg。
4.3旋涡混合器。
4.4离心机：转速≥4000 r/ min。
4.5超声波清洗器。
4.6样品粉碎设备：高速粉碎机。
4.7恒温干燥箱。
4.8恒温水浴装置。
5分析步骤
5.1样品前处理
5.1.1试样制备
取适量有代表性的样品，饮料等液态均匀样品直接摇匀；非均匀的样品需匀浆或粉碎均匀；冷冻饮品室温融化后充分搅拌均匀，必要时可采用30℃~40℃水浴加热搅拌；巧克力采用50℃~60℃水浴加热熔融，并趁热充分搅拌均匀。
5.1.2试样提取
5.1.2.1胶基糖果和巧克力等难溶解试样
称取试样2 g(精确至0.001 g)于100 ml比色管中，加入约50 ml 50℃~60℃热水，涡旋或搅拌，待样品充分溶解，再缓慢加入5 ml乙酸锌溶液和5 ml亚铁氰化钾溶液，涡旋混匀，超声30 min，转移至100 ml容量瓶中并用水定容至刻度，混匀，静置。
5.1.2.2含气体和酒精试样
称取混匀后的试样50 g(精确至0.01 g)于蒸发皿中，在水浴上微热搅拌去除气体和酒精，待冷却后移至100 ml容量瓶中，缓慢加入5 ml乙酸锌溶液和5 ml亚铁氰化钾溶液，用水定容至刻度，混匀，静置。
5.1.2.3糖浆和蜂蜜类试样
称取混匀后的试样1 g~2g(精确至0.001 g)于100 ml比色管中，加入约50 ml水，涡旋混匀至充分溶解，转移至100 ml容量瓶中并用水定容至刻度，混匀，静置。
5.1.2.4其他试样
称取粉碎或混匀后的试样1 g~10 g(精确至0.001 g)(目标糖含量≤5%时称取10 g；含量5%~
10%时称取5 g；含量10%~40%时称取2 g；含量≥40%时称取1 g)至100 ml比色管中，加入约50 ml水，再缓慢加入5 ml乙酸锌溶液和5 ml亚铁氰化钾溶液，涡旋混匀，超声30 min，转移至100 ml容量瓶中并用水定容至刻度，混匀，静置。
5.1.3净化
上述试样提取液用滤纸过滤(弃去初滤液)或离心获取上清液后，用0.45μm水性滤膜针头过滤器过滤至样品瓶，供高效液相色谱仪分析。
5.2仪器参考条件
仪器参考条件如下：
a)色谱柱：氨基色谱柱(4.6 mm×250 mm，粒径5μm，氨基硅烷键合硅胶为填充剂)，或性能相当者；
b)流动相：乙腈+水=70+ 30(体积比)；
c)流速：1.0 ml/ min；
d)柱温：40℃；
e)进样量：10μl；
f)示差折光检测器条件；温度40℃；
g)蒸发光散射检测器条件：飘移管温度80℃~90℃；氮气流速2.5 l/min。
5.3标准曲线的制作
将混合标准工作液按浓度从低到高依次注入高效液相色谱仪，测定果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖相应的峰面积或峰高。示差折光检测器以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积或峰高为纵坐标绘制标准曲线；蒸发光散射检测器以标准工作液浓度的幂函数为横坐标，以峰面积或峰高的幂函数为纵坐标绘制标准曲线。果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖标准溶液的高效液相色谱图参见附录a。
5.4试样溶液的测定
将试样溶液注入高效液相色谱仪中，根据保留时间定性，记录目标物的峰面积或峰高，根据标准曲线得到试样溶液中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的浓度。
5.5空白试验
除不加试样外，均按上述步骤进行。
6分析结果的表述
试样中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的含量按公式(1)计算。
式中：
x——试样中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的含量，单位为克每百克(g/100 g)；
ρ——根据标准曲线得到的试样溶液中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的质量浓度，单位为毫克每毫升(mg/ ml)；
ρ0——根据标准曲线得到的空白中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的质量浓度，单位为毫克每毫升(mg/ml)；
v——定容体积，单位为毫升( ml)；
f——稀释倍数；
n——试样的称样量，单位为克(g)；
1 000——换算系数；
100——换算系数。
糖的含量≥10 g/100 g时，计算结果保留3位有效数字；糖的含量<10 g/100 g时，计算结果保留2位有效数字。
7精密度
在重复条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
8其他
当称样量为10 g、定容体积为100 ml时，果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的方法检出限均为0.2 g/100 g，定量限均为0.5 g/100 g。
第二法离子色谱法
9原理
试样中的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖经提取净化后，离子色谱柱分离，脉冲安培检测器检测，外标法定量。
10试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为gb/t 6682规定的一级水。
10.1试剂
10.1.1氢氧化钠(naoh)：色谱纯。
10.1.2冰乙酸(ch3cooh)。
10.2试剂配制
10.2.1氢氧化钠溶液(200 mmol/l)：称取8.00 g氢氧化钠，溶于水并稀释至1 000 ml，混匀。
10.2.2乙酸溶液(3%，体积分数)：量取3 ml冰乙酸，用水稀释至100 ml，混匀。
10.3标准品
10.3.1果糖(c6h12o6，cas号：57-48-7)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
10.3.2葡萄糖(c6h12o6，cas号：50-99-7)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
10.3.3蔗糖(c12h22o11，cas号：57-50-1)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
10.3.4麦芽糖(c12h22o11，cas号：69-79-4)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
10.3.5乳糖(c12h22o11，cas号：63-42-3)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
10.4标准溶液的制备
10.4.1混合标准储备液(10.0 mg/ml)：分别称取经过90℃±2℃干燥2 h的果糖和96℃±2℃干燥2h的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖各1 g(精确至0.001 g)，加水溶解后转移至100 ml容量瓶中，加入2 ml乙酸溶液，并用水定容至刻度。置于0℃~4℃密封，保存期3个月。
10.4.2混合标准中间液(100 mg/l)：吸取1.00 ml果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖混合标准储备液(10.0 mg/ml)于100 ml容量瓶中，用水定容至刻度。置于0℃~4℃密封，保存期1个月。
10.4.3混合标准工作液：分别吸取0.250 ml、0.500 ml.1.00 ml、2.00 ml和2.50 ml混合标准中间液(100mg/l)于10ml容量瓶中，用水定容至刻度，配得果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的质量浓度为2.50 mg/l、5.00 mg/l、10.0 mg/l、20.0 mg/l和25.0 mg/l的混合标准工作液，可根据实际样品溶液的浓度适当调整混合标准工作液浓度。临用现配。
10.5材料
10.5.1 0.45μm水性滤膜针头过滤器(纤维素滤膜除外)。
10.5.2净化柱：c18固相萃取小柱(1.0 ml)或性能相当者。
10.5.3注射器。
11仪器和设备
11.1离子色谱仪：配脉冲安培检测器。
11.2样品粉碎设备：高速粉碎机。
11.3超声波清洗器。
11.4分析天平：感量为1 mg。
11.5旋涡混合器。
11.6离心机：转速≥4 000 r/ min。
11.7恒温干燥箱。
11.8恒温水浴装置。
12试验步骤
12.1样品前处理
12.1.1试样制备
取适量有代表性的样品，饮料等液态均匀样品直接摇匀；非均匀的样品需匀浆或粉碎均匀；冷冻饮品室温融化后充分搅拌均匀，必要时可采用30℃~40℃水浴加热搅拌；酱类等可以采用研磨或者均质混匀；巧克力采用50℃~60℃水浴中加热熔融，并趁热充分搅拌均匀。
12.1.2试样提取
12.1.2.1胶基糖果和巧克力等难溶解试样
准确称取试样2 g(精确至0.001 g)于100 ml比色管中，加入约50 ml 50℃~60℃热水，涡旋或搅拌，待样品充分溶解，加入2 ml乙酸溶液，涡旋混匀，超声30 min，转移至100 ml容量瓶中并用水定容至刻度，混匀，静置20 min。
12.1.2.2糖浆和蜂蜜类试样
称取混匀后的试样2 g(精确至0.001 g)于100 ml比色管中，加入约50 ml水，涡旋混匀至充分溶解，转移至100 ml容量瓶中并用水定容至刻度，混匀，静置20 min。
12.1.2.3含气体和酒精试样
准确称取试样10 g(精确至0.001 g)于蒸发皿中，在水浴上微热搅拌去除气体和酒精，待冷却后用水移至100 ml容量瓶中，加入2 ml乙酸溶液，用水定容至刻度，混匀，静置20 min。
12.1.2.4其他试样
称取固体试样2 g(精确至0.001 g)，半固态或液态试样5 g~10 g(精确至0.001 g)于100 ml比色管中，加入约50 ml水，涡旋混匀，再加入2 ml乙酸溶液混匀后，超声30 min，转移至100 ml容量瓶中并用水定容至刻度，混匀，静置20 min。
12.1.3试样净化
试样提取溶液可根据试样中目标糖含量稀释适当的倍数，婴幼儿配方乳粉中的乳糖检测时，稀释1000倍后净化；蜂蜜和糖果中高含量糖检测时，稀释500倍后净化。
上述试样提取溶液或稀释溶液采用滤纸过滤或离心获取上清液后，依次过0.45μm水性滤膜针头过滤器和c18固相萃取小柱(1.0 ml)，弃去前3 ml，收集后续的洗脱液待测。
c18固相萃取小柱(1.0 ml)使用前依次用10 ml甲醇、15 ml水通过，静置活化30 min。
12.2仪器参考条件
仪器参考条件如下：
a)色谱柱：阴离子交换柱(4 mm×250 mm，粒径10μm，以季铵盐为功能基，聚苯乙烯/二乙烯基苯聚合物树脂作为填料)(带保护柱4 mm×50 mm)，或性能相当者；
b)流速：1.0 ml/min；
c)进样量：10μl；
d)脉冲安培检测器：au工作电极；糖检测波形参考条件见表1；
e)淋洗液：淋洗液a：水；淋洗液b：氢氧化钠溶液(200 mmol/l)；洗脱参考条件见表2。
12.3标准工作曲线绘制
将混合标准工作液按浓度从低到高依次注入离子色谱仪，测定果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖相应的峰面积，以标准工作液中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，分别绘制标准曲线。果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖标准溶液的离子色谱图参见附录b。
12.4试样溶液的测定
将试样溶液注入离子色谱仪中，根据保留时间定性，记录峰面积，根据标准曲线得到试样溶液中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的浓度。
12.5空白试验
除不加试样外，均按上述步骤进行。
13分析结果的表述
试样中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的含量按公式(2)计算。
式中：
x——试样中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的含量，单位为克每百克(g/100 g)；
ρ——由标准曲线计算得到的试样溶液中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的质量浓度，单位为毫克每升(mg/l)；
ρ0——由标准曲线计算得到的空白中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的质量浓度，单位为毫克每升(mg/l)；
v——定容的体积，单位为毫升(ml)；
f——稀释倍数；
m——试样的称样量，单位为克(g)；
1000——换算系数；
10——换算系数。
糖的含量≥10 g/100 g时，计算结果保留3位有效数字；糖的含量<10 g/100 g时，计算结果保留2位有效数字。
14精密度
在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
15其他
当称样量为2 g、定容体积为100 ml时，果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的方法检出限均为0.015 g/100 g，定量限均为0.050 g/100 g。
第三法酸水解-莱因-埃农氏法
16原理
试样除去蛋白质后，其中蔗糖经盐酸水解转化为还原糖，按还原糖测定，水解前后的差值乘以相应的系数即为蔗糖含量。棉子糖、水苏糖、低聚半乳糖、果聚糖、聚葡萄糖和抗性糊精等会对蔗糖的测定产生干扰。
17试剂和溶液
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为gb/t6682规定的三级水。
17.1试剂
17.1.1乙酸锌[zn(ch3coo)2·2h2o]。
17.1.2亚铁氰化钾[k4fe(cn)6·3h2o]。
17.1.3盐酸(hci)。
17.1.4氢氧化钠(naoh)。
17.1.5甲基红(c15h15n3o2)：指示剂。
17.1.6亚甲基蓝(c16h18cln3s·3h2o)：指示剂。
17.1.7硫酸铜(cuso4·5h2o)。
17.1.8酒石酸钾钠(c4h4o6kna·4h2o)。
17.1.9冰乙酸(ch3cooh)。
17.1.10乙醇(c2h5oh)：95%。
17.2试剂配制
17.2.1乙酸锌溶液(1 mol/l)：称取乙酸锌21.9 g，加3 ml冰乙酸，溶于水并稀释至100 ml，混匀。
17.2.2亚铁氰化钾溶液(0.25 mol/l)：称取亚铁氰化钾10.6 g，溶于水并稀释至100 ml，混匀。
17.2.3盐酸溶液(50%，体积分数)：量取盐酸50 ml，缓慢加入50 ml水中，冷却后混匀。
17.2.4氢氧化钠溶液(40 g/l)：称取氢氧化钠4.0 g，加水溶解后，冷却，用水稀释至100 ml，混匀。
17.2.5甲基红指示液(1 g/l)：称取甲基红0.1 g，用95%乙醇溶解并稀释至100 ml，混匀。
17.2.6氢氧化钠溶液(200 g/l)：称取氢氧化钠20.0 g，加水溶解后，冷却，用水稀释至100 ml，混匀。
17.2.7碱性酒石酸铜甲液：称取硫酸铜15.0 g和亚甲基蓝0.05 g，溶于水并稀释至1 000 ml，混匀。
17.2.8碱性酒石酸铜乙液：称取酒石酸钾钠50.0 g和氢氧化钠75.0 g，溶于水中，再加入亚铁氰化钾4.0g，完全溶解后，用水稀释至1000ml，混匀，储存于橡胶塞玻璃瓶中。
17.3标准品
葡萄糖(c6h12o6，cas号：50-99-7)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
17.4标准溶液配制
葡萄糖标准溶液(1.00 mg/ml)：称取经过96℃±2℃烘箱中干燥2h的葡萄糖1 g(精确至0.001 g)，加水溶解后转移至1000ml的容量瓶中，加入5ml盐酸，并用水定容至刻度。置于0℃~4℃密封保存。
18仪器和设备
18.1分析天平：感量为1 mg和10 mg。
18.2恒温水浴装置。
18.3可调温电炉。
18.4酸式滴定管：25 ml。
18.5样品粉碎设备：高速粉碎机。
18.6恒温干燥箱。
19分析步骤
19.1样品前处理
19.1.1试样制备
取适量有代表性的样品，饮料等液态均匀样品直接摇匀；非均匀的样品需匀浆或粉碎均匀；冷冻饮品室温融化后充分搅拌均匀，必要时可采用30℃~40℃水浴加热搅拌；酱类等可以采用研磨或者均质混匀；巧克力采用50℃~60℃水浴中加热熔融，并趁热充分搅拌均匀。
19.1.2试样处理
19.1.2.1胶基糖果和巧克力等难溶解试样
称取试样2.5 g~5 g(精确至0.001 g)于100 ml烧杯中，加入约50 ml 50℃~60℃热水搅拌溶
解，再缓慢加入5 ml乙酸锌溶液和5 ml亚铁氰化钾溶液，混匀，放冷，转移至250 ml容量瓶中并用水定容至刻度，混匀，静置30 min，用滤纸过滤，弃去初滤液，取后续滤液备用。
19.1.2.2含淀粉试样
称取粉碎或混匀后的试样10g~20 g(精确至0.001 g)，置于烧杯中，加入约200 ml水，在45℃水浴中加热1 h，并振摇，冷却后转移至250 ml容量瓶中并定容，混匀，静置，沉淀。吸取200 ml上清液于另一250 ml容量瓶中，缓慢加入5 ml乙酸锌溶液和5 ml亚铁氰化钾溶液，用水定容至刻度，混匀，静置30min，用滤纸过滤，弃去初滤液，取后续滤液备用。
19.1.2.3含气体和酒精试样
称取混匀后的试样100 g(精确至0.01 g)，置于蒸发皿中，用氢氧化钠溶液(40 g/l)中和至中性，在水浴上微热搅拌去除气体和酒精，待冷却后移至250 ml容量瓶中，缓慢加入5 ml乙酸锌溶液和5 ml亚铁氰化钾溶液，用水定容至刻度，混匀，静置30min，用滤纸过滤，弃去初滤液，取后续滤液备用。
19.1.2.4其他试样
称取粉碎或混匀后的固体试样2.5g~5 g(精确至0.001 g)或液体试样5 g~25 g(精确至0.001 g)，
置于烧杯中，加入约50 ml水，缓慢加入5 ml乙酸锌溶液和5 ml亚铁氰化钾溶液，搅拌混匀转移至250 ml容量瓶中并用水定容至刻度，混匀，静置30 min，用滤纸过滤，弃去初滤液，取后续滤液备用。
19.2酸水解
吸取2份试样处理液各50.0 ml，分别置于100 ml容量瓶中。
19.2.1转化前：1份用水定容至刻度，混匀。
19.2.2转化后：1份加5 ml盐酸溶液，在68℃~70℃水浴中加热15 min，冷却后加2滴甲基红指示液，用氢氧化钠溶液(200 g/l)中和至中性，用水定容至刻度，混匀。
19.3标定碱性酒石酸铜溶液
吸取5.0 ml碱性酒石酸铜甲液和5.0 ml碱性酒石酸铜乙液于150 ml锥形瓶中，加入10 ml水，加2粒~4粒玻璃珠，从滴定管中加约9 ml葡萄糖标准溶液，控制在2 min内加热至沸，趁热以1滴/2 s的速度滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪尽为终点，记录消耗葡萄糖标准溶液总体积，同时平行操作3份，取其平均值，计算每10 ml碱性酒石酸铜溶液(碱性酒石酸甲、乙液各5 ml)相当于葡萄糖的质量a(mg)。
注：也可以按上述方法标定4ml~20ml碱性酒石酸铜溶液(甲、乙液各半)来适应试样中还原糖的浓度变化。
19.4试样溶液的测定
19.4.1预测滴定：吸取5.0 ml碱性酒石酸铜甲液和5.0 ml碱性酒石酸铜乙液于150 ml锥形瓶中，加入10 ml蒸馏水，加2粒~4粒玻璃珠，置于电炉.上加热，使其在2 min内沸腾，保持沸腾状态15 s，滴入转化前样液(19.2.1)或转化后样液(19.2.2)至溶液蓝色刚好褪尽为终点，读取所用样液的体积。
19.4.2精确滴定：吸取5.0 ml碱性酒石酸铜甲液和5.0 ml碱性酒石酸铜乙液于150 ml锥形瓶中，加入10ml蒸馏水，加2粒~4粒玻璃珠，从滴定管中放出比预测滴定(19.4.1)预测体积少1ml的样液，置于电炉上，使其在2min内沸腾，维持沸腾状态2min，以1滴/2s的速度徐徐滴入样液，至溶液蓝色刚好褪尽为终点，记录样液消耗的体积(v)。
注：当样液还原糖浓度过低时，可以采用反滴定的方式进行测定。吸取5.00 ml碱性酒石酸铜甲液及5.00 ml碱性酒石酸铜乙液至锥形瓶中，直接加入10.0 ml样液，免去加水10 ml，再用葡萄糖标准溶液滴定至终点，记录消耗的体积。消耗体积与标定时消耗的葡萄糖标准溶液体积之差相当于10 ml样液中所含葡萄糖的量a1(mg)。
20分析结果的表述
20.1还原糖的含量
试样中还原糖(以葡萄糖计)的含量按公式(3)计算。
式中：
r——试样中还原糖(以葡萄糖计)的质量分数，单位为克每百克(g/100 g)；
a——碱性酒石酸铜溶液(甲、乙液各半)相当于葡萄糖的质量，单位为毫克(mg)；
m——试样的称样量，单位为克(g)；
50——酸水解(19.2)中吸取样液体积，单位为毫升(ml)；
250——试样处理(19.1)中定容体积，单位为毫升(ml)；
v——滴定时消耗样液体积，单位为毫升(ml)；
100——酸水解(19.2)中定容体积，单位为毫升(ml)；
1 000——换算系数；
f——当使用19.1.2.2步骤时，f= 1.25；其他步骤时，f=1；
100——换算系数。
采用反滴定方式测定时，试样中还原糖(以葡萄糖计)的含量按公式(4)计算。
式中：
r——试样中还原糖(以葡萄糖计)的质量分数，单位为克每百克(g/100 g)；
a1——标定10ml碱性酒石酸铜溶液(甲、乙液各半)时消耗的葡萄糖标准溶液的体积与加入
10ml样液后消耗的葡萄糖标准溶液体积之差相当于葡萄糖的质量，单位为毫克(mg)；
m——试样的称样量，单位为克(g)；
50——酸水解(19.2)中吸取样液体积，单位为毫升(ml)；
250——试样处理(19.1)中定容体积，单位为毫升(ml)；
10——直接加入的样液体积，单位为毫升(ml)；
100——酸水解(19.2)中定容体积，单位为毫升(ml)；
1 000——换算系数；
f——当使用19.1.2.2步骤时，f=1.25；其他步骤时，f=1；
100——换算系数。
20.2蔗糖的含量
试样中蔗糖的含量按公式(5)计算。
式中：
x——试样中蔗糖的质量分数，单位为克每百克(g/100 g)；
r2——转化后还原糖(以葡萄糖计)的质量分数，单位为克每百克(g/100g)；
r1——转化前还原糖(以葡萄糖计)的质量分数，单位为克每百克(g/100g)；
0.95——还原糖(以葡萄糖计)换算为蔗糖的系数。
蔗糖含量≥10 g/100g时，计算结果保留3位有效数字；蔗糖含量<10 g/100 g时，计算结果保留2位有效数字。
21精密度
在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
第四法莱因-埃农氏法
22原理
试样除去蛋白质后，在加热条件下，以亚甲基蓝为指示剂，直接滴定已标定过的费林氏液，根据样液消耗的体积，计算乳糖含量。果糖、葡萄糖、麦芽糖和低聚半乳糖等会对乳糖的测定产生干扰。
23试剂和材料
除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为gb/t 6682规定的三级水。
23.1试剂
23.1.1乙酸铅[pb(ch3coo)2·3h2o]。
23.1.2草酸钾(k2c2o4·h2o)。
23.1.3磷酸氢二钠(na2hpo4)。
23.1.4硫酸铜(cuso4·5h2o)。
23.1.5浓硫酸(h2so4)：98%。
23.1.6酒石酸钾钠(c4h4o6kna·4h2o)。
23.1.7氢氧化钠(naoh)。
23.1.8亚甲基蓝(c16 h18cln3s·3h2o)：指示剂。
23.2试剂配制
23.2.1乙酸铅溶液(200 g/l)：称取200 g乙酸铅，用水稀释至1 000 ml，混匀。
23.2.2草酸钾-磷酸氢二钠溶液：称取草酸钾30 g，磷酸氢二钠70 g，用水稀释至1 000 ml，混匀。
23.2.3亚甲基蓝溶液(10 g/l)：称取1 g亚甲基蓝于100 ml水中，混匀。
23.2.4费林氏液(甲液和乙液)
23.2.4.1甲液：称取34.639 g硫酸铜，溶于水中，加入0.5 ml浓硫酸，加水至500 ml，混匀。
23.2.4.2乙液：称取173 g酒石酸钾钠及50 g氢氧化钠溶解于水中，稀释至500 ml，混匀，静置2 d后过滤。
23.3标准品
23.3.1乳糖(c12h22o11，cas号：63-42-3)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
24仪器和设备
24.1天平：感量为0.1 mg。
24.2可调温电炉。
24.3酸式滴定管：50 ml。
24.4恒温干燥箱。
25分析步骤
25.1费林氏液的标定
25.1.1称取经过96℃±2℃烘箱中干燥2 h的乳糖约0.75 g(精确至0.1 mg)，用水溶解并定容至250 ml。将此乳糖溶液注入一个50 ml滴定管中，待滴定。
25.1.2预测滴定：吸取10 ml费林氏液(甲、乙液各5 ml)于250 ml三角烧瓶中。加入20 ml蒸馏水，放入几粒玻璃珠，从滴定管中放出15 ml样液于三角瓶中，置于电炉上加热，使其在2 min内沸腾，保持沸腾状态15s，加入3滴亚甲基蓝溶液，继续滴入样液至溶液蓝色完全褪尽为止，读取所用样液的体积。
25.1.3精确滴定：另取10 ml费林氏液(甲、乙液各5 ml)于250 ml三角烧瓶中，再加入20 ml蒸馏水，放入几粒玻璃珠，加入比预滴定量少0.5 ml~1.0 ml的样液，置于电炉上，使其在2 min内沸腾，维持沸腾状态2 min，加入3滴亚甲基蓝溶液，以1滴/2s的速度徐徐滴入样液，溶液蓝色完全褪尽即为终点，记录消耗样液的体积。
25.1.4费林氏液的乳糖校正值(f )按公式(6)和公式(7)计算。
式中：
a——实测乳糖数，单位为毫克(mg)；
v1——滴定时消耗乳糖溶液的体积，单位为毫升(ml)；
m1——称取乳糖的质量，单位为克(g)；
f——费林氏液的乳糖校正值；
al——由乳糖溶液滴定毫升数查表3所得的乳糖数，单位为毫克(mg)。
25.2乳糖的测定
25.2.1试样处理
称取婴幼儿食品或脱脂粉2 g、全脂加糖粉或全脂粉2.5g、乳清粉1 g，精确至0.1 mg，置于烧杯中，用约100 ml水溶解并分数次洗入250 ml容量瓶中，徐徐加入4 ml乙酸铅溶液和4 ml草酸钾-磷酸氢二钠溶液，并摇动容量瓶，用水定容至刻度，混匀，静置数分钟，用干燥滤纸过滤，弃去最初25 ml滤液，取后续滤液待滴定。
25.2.2滴定
25.2.2.1预测滴定：操作同25.1.2。
25.2.2.2精确滴定：操作同25.1.3。
26分析结果的表述
试样中乳糖的含量x按公式(8)计算。
式中：
x——试样中乳糖的质量分数，单位为克每百克(g/100 g)；
f——由消耗样液的毫升数查表3所得乳糖数，单位为毫克( mg)；
f——费林氏液乳糖校正值；
v——滴定消耗样液量，单位为毫升(ml)；
m——试样的质量，单位为克(g)。
结果保留3位有效数字。
注：若试样中蔗糖与乳糖之比超过3：1时，则计算乳糖时应在滴定量中加上表4中的校正值数后再查表3。
27精密度
在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的1.5%。
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