qPCR检测支原体方法略述
和pcr比起来，qpcr不用跑胶，实时监测扩增状况，操作更为便捷。下面以德国mbvenor®gem支原体检测试剂盒（qpcr一步法）（venor®gem qonestep）为例，略述检测原理和过程。
该试剂盒包括4管试剂，其中2管分别为缓冲液和pcr水，另2管为主要试剂。1管即mix，含引物、核苷酸、聚合酶、荧光素标记的探针和内部扩增对照。另1管为阳性对照，均为冻干粉。
它通过扩增高度保守的rrna操纵子，或者更准确地说，扩增支原体基因组中的16s rrna编码区，可以特异性地检测支原体。在520nm（famtm通道）检测支原体特异性扩增片段。在610nm（hextm通道）检测内部扩增对照的扩增。它能特异性检测所有导致细胞污染的柔膜体物种。真核dna不会被扩增。通过内部对照，可检测pcr抑制剂的存在或不正确的dna提取引起的假阴性结果。样本为细胞培养上清液。检测程序可在3小时内完成。在检测前，样本需要一定的制备。具体是将100μl细胞培养上清液转移至无菌的1.5 ml反应管中。关上盖子扣紧。将样品在95°c下孵育5分钟。以大速度短暂离心样品（15秒）以沉淀任何细胞碎片。然后可直接取2μl上清液进行qpcr。
qpcr反应体系一共是25ul，其中样本2ul，其余是master mix。注意设置阳性对照、阴性对照（无模板对照）。
如果检测的ct<40，则表明pcr结果阳性。如果检测的ct≥40，则pcr反应结果为阴性。如果fam阳性，则支原体阳性。如果fam阴性，hex也阴性，表明pcr扩增出了问题，需要重做。如果fam阴性，hex阳性，表明支原体确实阴性。
pcr扩增出了问题主要原因为pcr反应被抑制了，可能需要考虑做dna抽提。
在qpcr反应中，引物和探针的设计尤为重要，它既需要覆盖大多数支原体，又需要不与细菌和哺乳动物细胞dna发生交叉反应。当然，taq酶的性能也很重要，因为dna的扩增终依赖于酶的活性和扩增的速度。从这个角度说，一个好的qpcr试剂盒是各个因素共同作用的结果。
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