免疫组化实验步骤及常见问题分析
免疫组化实验步骤及常见问题分析
免疫组化实验流程
1.样品制备
2.组织固定：根据要求收集人或动物的组织用于ihc分析，冲洗并用固定剂（一般用甲醛）进行固定
3.组织包埋：将经甲醛固定的组织嵌入石蜡，以长期保持其天然形状和组织结构
4.切片安装：将组织样品在切片机上切片，并转移至载玻片上干燥保持其形态
5.脱蜡水化：因切片上的石蜡会妨碍染色，所以需将切片上的石蜡溶出，并水化。脱蜡或水化不全容易造成非特异性背景着色（一般的脱蜡水化步骤是：将切片依次浸入二甲苯ⅰ10min-二甲苯ⅱ10min-无水乙醇5min-95%无水乙醇5min-90%无水乙醇5min-80%无水乙醇5min-70%无水乙醇5min-50%无水乙醇5min-蒸馏水5min×3，进行脱蜡水化）。
6.抗原修复：由于组织在甲醛固定过程中，蛋白之间发生了交联及醛基的封闭从而掩盖抗原决定簇。可以通过高压加热修复抗原，使细胞内抗原决定族暴露，从而提高抗原检测率。
7.非特定位点封闭：为了防止一抗的非特异性结合造成假阳性，可以选用bsa、羊血清等封闭非特异性结合位点。封闭血清来源一般与二抗保持一致，室温封闭10-30min。
8.样品染色
一抗、二抗孵育：抗体孵育时间、温度及浓度等因素对染色结果都存在很大影响。在4℃下反应缓慢，背景较浅；37℃反应较快时间较短；而室温介于两者之间，选择室温有利于实验的进行。二抗一般室温孵育30min。
底物显色：基于与酶缀合的二抗，抗原通过生色或荧光方式直接检测。
复染封片：组化染色后进行复染可以衬托出组织形态结构，常用的复染剂有苏木精、曙红、甲基绿、dapi和hoechst荧光染色。观察结束后使用中性树胶进行封片，可以长久保存。
免疫组化实验常见问题分析
1. ihc实验结果显色过深
一抗浓度过高或孵育时间过长——降低一抗浓度或减少孵育时间
孵育温度过高——选择4℃或室温孵育
2. 实验结果存在非特异性显色
石蜡切片脱蜡不够——延长脱蜡时间
蛋白封闭不充分——增加蛋白封闭时间
组织富含内源性生物素与过氧化物酶——使用相关试剂进行封闭
3. 实验结果显色弱或无染色
一抗浓度过低或孵育时间过短——增加一抗浓度或延长孵育时间
组织中无目的抗原的表达：一抗种属来源与二抗不匹配
免疫组化实验注意事项
切片脱蜡和水化要充分，加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，同时防止干片。
一抗的冲洗原则：单独冲洗，防交叉反应污染；温柔冲洗，防止切片脱落；可采用浸洗方式。
有条件的话立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。
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免疫组化实验流程
1.样品制备
2.组织固定：根据要求收集人或动物的组织用于ihc分析，冲洗并用固定剂（一般用甲醛）进行固定
3.组织包埋：将经甲醛固定的组织嵌入石蜡，以长期保持其天然形状和组织结构
4.切片安装：将组织样品在切片机上切片，并转移至载玻片上干燥保持其形态
5.脱蜡水化：因切片上的石蜡会妨碍染色，所以需将切片上的石蜡溶出，并水化。脱蜡或水化不全容易造成非特异性背景着色（一般的脱蜡水化步骤是：将切片依次浸入二甲苯ⅰ10min-二甲苯ⅱ10min-无水乙醇5min-95%无水乙醇5min-90%无水乙醇5min-80%无水乙醇5min-70%无水乙醇5min-50%无水乙醇5min-蒸馏水5min×3，进行脱蜡水化）。
6.抗原修复：由于组织在甲醛固定过程中，蛋白之间发生了交联及醛基的封闭从而掩盖抗原决定簇。可以通过高压加热修复抗原，使细胞内抗原决定族暴露，从而提高抗原检测率。
7.非特定位点封闭：为了防止一抗的非特异性结合造成假阳性，可以选用bsa、羊血清等封闭非特异性结合位点。封闭血清来源一般与二抗保持一致，室温封闭10-30min。
8.样品染色
一抗、二抗孵育：抗体孵育时间、温度及浓度等因素对染色结果都存在很大影响。在4℃下反应缓慢，背景较浅；37℃反应较快时间较短；而室温介于两者之间，选择室温有利于实验的进行。二抗一般室温孵育30min。
底物显色：基于与酶缀合的二抗，抗原通过生色或荧光方式直接检测。
复染封片：组化染色后进行复染可以衬托出组织形态结构，常用的复染剂有苏木精、曙红、甲基绿、dapi和hoechst荧光染色。观察结束后使用中性树胶进行封片，可以长久保存。
免疫组化实验常见问题分析
1. ihc实验结果显色过深
一抗浓度过高或孵育时间过长——降低一抗浓度或减少孵育时间
孵育温度过高——选择4℃或室温孵育
2. 实验结果存在非特异性显色
石蜡切片脱蜡不够——延长脱蜡时间
蛋白封闭不充分——增加蛋白封闭时间
组织富含内源性生物素与过氧化物酶——使用相关试剂进行封闭
3. 实验结果显色弱或无染色
一抗浓度过低或孵育时间过短——增加一抗浓度或延长孵育时间
组织中无目的抗原的表达：一抗种属来源与二抗不匹配
免疫组化实验注意事项
切片脱蜡和水化要充分，加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，同时防止干片。
一抗的冲洗原则：单独冲洗，防交叉反应污染；温柔冲洗，防止切片脱落；可采用浸洗方式。
有条件的话立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。
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