步态分析系统在骨重建修复后疼痛缓解新疗法的研究应用
该研究有*意义，是有史以来篇用步态分析系统（catwalk）来评价骨重建中疼痛缓解，并用局部麻醉镇痛的文章。文章来源于the journal of pain（2017年影响因子4.859），2018年5月15日发表，本文将为大家做详细阐述。
有文献报道这种疼痛是自体骨移植术后的主要并发症之一, 可能危及手术全程的成功，这种疼痛必须在术后3-4天内得到控制和减少，以防止它变成慢性的。术后前四周的疼痛护理会更地降低其转化成慢性疼痛的风险。
传统治疗会给予系统的镇痛剂，比如*，非甾体抗炎药和含*的药品，这些传统的对身体的损副作用和伤害大，同时镇痛剂处方会增加总体花费。磷酸钙（cap）骨替代物和cap*（cpc）现在被认为是许多骨填充骨科手术适应症的标准治疗方法。
它们可以被细胞吸收，具有明显的骨传导特性，作为局部药物传递系统，可以与生物活性分子和治疗剂结合。由于cpcs已成为许多骨科及外伤适应症的治疗方法，因此作者设计了一种新型的生物注射材料，将cpc与不同的局部麻醉药粘合在一起，用于骨科或骨外伤适应症。
作者目的是1）通过步态分析系统（catwalk）对骨填充手术术后疼痛进行功能评价；2）评价骨损伤填充手术结合使用的磷酸钙水泥对于术后疼痛的缓解；3）评估他们的机械和生物学性能。具体方法是利用手术在大鼠股骨远端制造了一个临界大小的骨缺损模型，并在其损伤处以装载或不装载带局部麻醉剂的注射用*（cpc）为填充来缓解骨重建修复术后的疼痛。
通过使用步态分析系统（catwalk）所测量的步态的变化来对比不同的cpc装载材料对于cpc骨重建修复手术后创伤疼痛的缓解。结果表明，术后短期时间内，在脚印面积和脚印平均接触强度这两个指标上两种镇痛方法都有显著的疼痛缓解。与术前的基础值相比，cpc组，装载*cpc组(cpc-ropi)，和装载丁哌卡因cpc组 (cpc-bupi)在第24小时，脚印面积值分别降低了65%, 42%和24%，同时脚印平均接触强度也分别降低了25%, 9%和1%。cpc-bupi比cpc-ropi有更的功能康复效果。
除此之外，cpc手术保持了机械和生物学性能。这步态结果可能乍一看有点不思其解，这三个组都比对照组降低了啊，怎么说明哪个比哪个好呢？ 这个结果侧面说明了疼痛程度，对照组的肯定高，这三个手术组的老鼠疼啊，所以脚爪接触面积和接触强度肯定是都降低的，哪个方法效果更佳，肯定是降低的数值更少的那个了。
在过去的十年里，步态分析系统（catwalk）已经被证明是一种*的评估慢性疼痛的方法，被证实为研究啮齿类动物许多疾病模型的方法工具，如神经退行性疾病，肌筋膜炎症，周围神经损伤，骨关节炎，外伤。该方法通过视频跟踪分析步态，对每个爪印的时空参数和动态肢体协调进行了完整的分析。
上图所示，大鼠术后步态分析采用步态分析系统（catwalk）具体参考之前文献报道，总的来说catwalk的原理是：大鼠在一条8厘米宽的走廊里，非强迫自主穿过一块发光的玻璃板，与玻璃板接触后，脚爪把绿灯反射到下面的摄像机（100hz）上，摄像机就会记录整个运动的过程。每只动物的每一次实验的步态相关指标都会被系统记录，整个过程没有食物诱导刺激。
手术过程见下图：
图1，*手术过程
a）手术一个圆柱状尺寸合适的切口；（b）填充注射*修复；（c）在缝合之前填充切口
实验分组：3个cpc实验组，其实还有1个隐藏组（control）：手术前后的自身对比
1. control group (preoperation的control组)
2. cpc unloaded with anesthetic agent (cpc组)
3. cpc loaded with 8% bupivacaine (cpc-bupi组)
4. cpc loaded with 8% ropivacaine (cpc-ropi组)
实验protocol：手术前两周，每天让大鼠适应走廊环境在其中自由活动，手术前一天的适应训练的数据作为术前参考值。为了排除个体差异性，用每一只自身手术前后的值来对比统计。分别在手术后第2,4,6,24,48,72小时,以及第7天第14天测catwalk数据。步态分析实验对清楚磷酸钙水泥的相同实验员设盲，开始操作注射水泥的时间记为第0天。
下来是实验装置和具体统计的数据：步态分析系统的走廊长42cm，符合标准的步态会被记录：1）通过走廊全程的时间在1-5秒之间；2）速度大变化不超过80%，标准之外的数据系统不会去采集记录（图2a）。统计以下数据：
1、脚印面积 (cm2) 是在站立时相完整脚印的表面积（图2b）。
2、脚印平均接触强度（au）：完整脚印在一个步长周期中步态支撑期接触的平均强度（图2c）。
3、脚印长度（cm）：第三指中间到脚后跟的距离（图2c）。
4、支撑期比重（%）：在一个步长周期中，支撑期所占比重（图2d）。
这四个指标都是经典的用来衡量疼痛与康复的数据，其中脚印平均接触强度被报过用来评估神经性疼痛，包括机械性痛觉超敏。
图2， 健康大鼠的步态分析效果图
（a）对照组大鼠在catwalk系统上的背景图；（b）术前的catwalk脚印（脚印面积）左脚印红色，右脚印蓝色，后肢显示浅色，前肢深色；（c）一个正常大鼠的右后腿爪，显示出的手动脚印测量长度和脚印接触强度；（d）术前catwalk步态图
除了做步态分析外，作者还做了扫描电镜和组织学实验，更进一步验证自己的实验。在leo 1450vp扫描电镜图像下，手动标记兴趣区（活性区域）包括新形成的骨和水泥吸收的表面部分，这个在后面具体的电镜数据上来直观地观察这三个部分的变化。
图3，股骨植入后的扫描电镜图像
使用leica qwin pro软件来分析兴趣区，具体是：（a）生物活性区（浅蓝色区域），它包括了（b）新形成的骨头（绿色区域）和（c）*吸收的表面（蓝色区域）。
接下来就是数据结果分析了，首先是catwalk的结果分析：手术前，动物步态正常，与对侧相比，右后腿爪的印纹面积和印纹长度没有显著差异。术前基础参考的平均值为：脚印面面积1.88±0.03 cm2，脚印平均接触强度115.28±0.55 au，脚印长度1.86±0.02cm2，支撑期比重66.34%±0.56%。
图和6a显示的是手术前后脚印面积的变化。cpc组脚印面积从2.04±0.07 cm2手术前的值下降到24小时之后的0.66±0.06 cm2，14天以后逐渐增加到1.60±0.06 cm2。在这两种*中，在术后次减少后，与未加载的cpc在14天时相比，两种均可以更快地恢复到基线值。
术后24小时，*处理大鼠的步态变化达到高水平（从基础值降到低），这说明了cpc-bupi和cpc-ropi组的相比cpc组脚印面积有了显著增加（p＜0.01）：cpc-bupi组1.44±0.06 cm2，cpc-ropi组1.10±0.06 cm2，图5b中脚印图也可以很直观的对应此结果。与此同时，两种水泥之间也是有差异的，cpc-bupi组脚印面积明显大。术后48小时后，两种水泥跟cpc相比，依然有差异，一直持续到第7天，cpc-bupi组恢复到手术前的基础值时才消失。
图5，实验组术后右后爪的脚印面积
(a) cpc组表示为黄色实线，cpc-bupi组蓝色点虚线，pc-ropi组绿色点划线，手术前的参考组黑色虚线。用双因素方差分析，事后分析fisher检验，结果表示为平均值±标准差(n = 6),* p < 0.01 (cpc-bupi vs cpc-ropi vs cpc),** p < 0.01 anesthetic loaded-cpcs vs cpc, # p < 0.01 cpc-bupi vs others；（b）手术后24小时每组脚印面积图
接触强度的结果也是这样（图6b）。术后24小时，与术前基础值相比，cpc组，cpc-bupi和cpc-ropi组分别下降了25%±2%，9%±2%，1%±2%。这三组互相比较都有显著差异（p＜0.01），48小时后，cpc组下降至低（79%±2%），分别与cpc-ropi组（96%±2%）和cpc-bupi组（98%±2%）比较。有趣的是，cpc-ropi组全程跟术前的基础值相比都没有统计差异，这一点很费解。术后第14天，cpc组和cpc-bupi组开始回到基础值，这种差异才消失。
与脚印面积结果一致，脚印长度在术后是降低的（图6c）。24小时后，cpc组脚印长度的值为72%±2%，cpc-bupi组和cpc-ropi组分别为91±2%，88±2%，与cpc组相比这两组都有统计差异（p＜0.01），但是cpc-bupi组和cpc-ropi组本身没差异。7天后，这两组与术前基础值相比也没差异了。
图6，三种*的4种测试参数
（a）术前脚印面积的基础值；（b）术前脚印接触强度的基础值；（c）脚印长度占术前的百分比重；（d）支撑期比重占术前的基础值百分比；cpc组表示为黄色实线，cpc-bupi组蓝色点虚线，pc-ropi组绿色点划线，手术前的参考组黑色虚线。用双因素方差分析，事后分析fisher检验，结果表示为平均值±标准差(n = 6), * p < 0.01 (cpc-bupi vs cpc-ropi vs cpc), ** p < 0.01 loaded-cpcs vs cpc, # p < 0.01 cpc-bupi vs others
支撑期比重在整个手术过程中都没有表现出来差异，这两种水泥组也没有差异。相反，在24小时后，cpc组支撑起比重值降低并且和两种水泥组相比有显著差异（p＜0.01）：cpc组84%±2%，cpc-ropi组95%±2%和cpc-bupi组99%±2%。术后48小时开始差异消失，第7天恢复至术前的值。
结果除了步态分析，还有sem（扫描电镜）和组织学结果分析，可见作者实验设计的严格和缜密，手术3周后，注射植入的*仍然在注射的位置可见，同时新生的骨质层相同位置也能观察到* (图7a)。
不仅如此，所有*均观察到骨样组织与成骨细胞细胞系交界，这说明使用三种不同的*，不影响新生骨质的生长。在所有的*（与骨组织之间），可以看到骨组织被一条由成骨细胞排成的线标记出边沿，这说明不同*中的药物的释放，并没有改变骨质-*界面和骨修复。
上图7为（a）手术后的扫描电镜图像；（b）结果表示为新骨形成相比于兴趣区的百分率
图8术后3周后股骨标本的组织学分析。（a）movat染色法观察全水泥置入后的效果（蓝色=水泥；黄色-绿色=骨，淡粉色=软组织）；（b）movat染色下的新骨形成的详细图像（红线=骨样组织，紫线=成骨细胞细胞株）；（c）苏木素-伊红染色观察骨髓
步态和扫描电镜做完了，作者还不放心，又做了组织学的实验，组织学分析没有发现任何不良炎症反应，(图8)。图8a 显示的是在植入*手术后整个movat’s染色的图（蓝色=水泥；黄色-绿色=骨，淡粉色=软组织） movat染色法能在一张组织切片上确定多种结缔组织成分，能有效的区分软骨的钙化，能明显的区分成骨细胞破骨细胞和其他成分，在研究骨的生长和修复中起关键作用。还有更细节的地方，染色图里的新骨形成图8b（红线=骨样组织，紫线=成骨细胞细胞株），与未加载的cpc相比，药物的局部释放并没有改变加载cpcs的*界面和骨结合，后再来个苏木素-伊红染色看看骨髓的情况。
作者很严谨，后提出了出于动物伦理原因，手术过程中作为麻醉动物用的盐酸丁丙诺非是按先发镇痛作用皮下注射的，半衰期比*还长（大于6小时），所以担心这种*麻醉作用影响catwalk早期阶段的数据，同时手术情况和catwalk实行双盲，也是严谨的另一面。到这里就算做完了，得出结论：本文的意义在于开创了一个用来评价骨重建修复引起的疼痛的指导方法：catwalk步态分析体统从行为上直观直接的测试，并且用了这种cpc材料和局部麻醉剂的结合来研究骨手术术后重建疼痛的缓解，对该领域的研究起到指导和借鉴作用。
参考文献：
1. maharaj mm, phan k, mobbs rj. anterior cervicaldiscectomy and fusion (acdf) autograft versus graft substitutes: what dopatients prefer—a clinical study. j spine surg 2:105-110, 2016.
2. vrinten dh, hamers ff. ‘catwalk’ automated quantitativegait analysis as a novel method to assess mechanical allodynia in the rat; a comparisonwith von frey testing. pain 102:203-209, 2003.
3. coulthard p, pleuvry bj, brewster m, et al. gait analysisas an objective measure in a chronic pain model. j neurosci methods116:197-213, 2002.
4. vandeputte c, taymans j-m, casteels c,et al. automatedquantitative gait analysis in animal models of movement disorders. bmc neurosci11:1, 2010.
5. miyagi m, ishikawa t, kamoda h, et al. takahashi k, inoueg, ohtori s: assessment of gait in a rat model of myofascial inflammation usingthe catwalk system: spine 36:1760-4, 2011.
6. chen y-j, cheng f-c, sheu m-l, et al. pan h-c: detectionof subtle neurological alterations by the catwalk xt gait analysis system. jneuroengineering rehabil 11:1, 2014.
7. ferland ce, laverty s, beaudry f, et al. gait analysis andpain response of two rodent models of osteoarthritis. pharmacol biochem behav97:603-610, 2011.
8. gabriel af, marcus mae, honig wmm, et al. the catwalkmethod: a detailed analysis of behavioral changes after acute inflammatory painin the rat. j neurosci methods 163:9-16, 2007.
9. hamers fpt, lankhorst aj, van laar tj, et al. automatedquantitative gait analysis during overground locomotion in the rat: itsapplication to spinal cord contusion and transection injuries. j neurotrauma 18:187-201,2001.
10. olah aj, simon a, gaudy m, et al. differential stainingof calcified tissues in plastic embedded microtome sections by a modificationof movat's pentachrome stain. stain technol. 1977 nov;52(6):331-7.
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传统治疗会给予系统的镇痛剂，比如*，非甾体抗炎药和含*的药品，这些传统的对身体的损副作用和伤害大，同时镇痛剂处方会增加总体花费。磷酸钙（cap）骨替代物和cap*（cpc）现在被认为是许多骨填充骨科手术适应症的标准治疗方法。
它们可以被细胞吸收，具有明显的骨传导特性，作为局部药物传递系统，可以与生物活性分子和治疗剂结合。由于cpcs已成为许多骨科及外伤适应症的治疗方法，因此作者设计了一种新型的生物注射材料，将cpc与不同的局部麻醉药粘合在一起，用于骨科或骨外伤适应症。
作者目的是1）通过步态分析系统（catwalk）对骨填充手术术后疼痛进行功能评价；2）评价骨损伤填充手术结合使用的磷酸钙水泥对于术后疼痛的缓解；3）评估他们的机械和生物学性能。具体方法是利用手术在大鼠股骨远端制造了一个临界大小的骨缺损模型，并在其损伤处以装载或不装载带局部麻醉剂的注射用*（cpc）为填充来缓解骨重建修复术后的疼痛。
通过使用步态分析系统（catwalk）所测量的步态的变化来对比不同的cpc装载材料对于cpc骨重建修复手术后创伤疼痛的缓解。结果表明，术后短期时间内，在脚印面积和脚印平均接触强度这两个指标上两种镇痛方法都有显著的疼痛缓解。与术前的基础值相比，cpc组，装载*cpc组(cpc-ropi)，和装载丁哌卡因cpc组 (cpc-bupi)在第24小时，脚印面积值分别降低了65%, 42%和24%，同时脚印平均接触强度也分别降低了25%, 9%和1%。cpc-bupi比cpc-ropi有更的功能康复效果。
除此之外，cpc手术保持了机械和生物学性能。这步态结果可能乍一看有点不思其解，这三个组都比对照组降低了啊，怎么说明哪个比哪个好呢？ 这个结果侧面说明了疼痛程度，对照组的肯定高，这三个手术组的老鼠疼啊，所以脚爪接触面积和接触强度肯定是都降低的，哪个方法效果更佳，肯定是降低的数值更少的那个了。
在过去的十年里，步态分析系统（catwalk）已经被证明是一种*的评估慢性疼痛的方法，被证实为研究啮齿类动物许多疾病模型的方法工具，如神经退行性疾病，肌筋膜炎症，周围神经损伤，骨关节炎，外伤。该方法通过视频跟踪分析步态，对每个爪印的时空参数和动态肢体协调进行了完整的分析。
上图所示，大鼠术后步态分析采用步态分析系统（catwalk）具体参考之前文献报道，总的来说catwalk的原理是：大鼠在一条8厘米宽的走廊里，非强迫自主穿过一块发光的玻璃板，与玻璃板接触后，脚爪把绿灯反射到下面的摄像机（100hz）上，摄像机就会记录整个运动的过程。每只动物的每一次实验的步态相关指标都会被系统记录，整个过程没有食物诱导刺激。
手术过程见下图：
图1，*手术过程
a）手术一个圆柱状尺寸合适的切口；（b）填充注射*修复；（c）在缝合之前填充切口
实验分组：3个cpc实验组，其实还有1个隐藏组（control）：手术前后的自身对比
1. control group (preoperation的control组)
2. cpc unloaded with anesthetic agent (cpc组)
3. cpc loaded with 8% bupivacaine (cpc-bupi组)
4. cpc loaded with 8% ropivacaine (cpc-ropi组)
实验protocol：手术前两周，每天让大鼠适应走廊环境在其中自由活动，手术前一天的适应训练的数据作为术前参考值。为了排除个体差异性，用每一只自身手术前后的值来对比统计。分别在手术后第2,4,6,24,48,72小时,以及第7天第14天测catwalk数据。步态分析实验对清楚磷酸钙水泥的相同实验员设盲，开始操作注射水泥的时间记为第0天。
下来是实验装置和具体统计的数据：步态分析系统的走廊长42cm，符合标准的步态会被记录：1）通过走廊全程的时间在1-5秒之间；2）速度大变化不超过80%，标准之外的数据系统不会去采集记录（图2a）。统计以下数据：
1、脚印面积 (cm2) 是在站立时相完整脚印的表面积（图2b）。
2、脚印平均接触强度（au）：完整脚印在一个步长周期中步态支撑期接触的平均强度（图2c）。
3、脚印长度（cm）：第三指中间到脚后跟的距离（图2c）。
4、支撑期比重（%）：在一个步长周期中，支撑期所占比重（图2d）。
这四个指标都是经典的用来衡量疼痛与康复的数据，其中脚印平均接触强度被报过用来评估神经性疼痛，包括机械性痛觉超敏。
图2， 健康大鼠的步态分析效果图
（a）对照组大鼠在catwalk系统上的背景图；（b）术前的catwalk脚印（脚印面积）左脚印红色，右脚印蓝色，后肢显示浅色，前肢深色；（c）一个正常大鼠的右后腿爪，显示出的手动脚印测量长度和脚印接触强度；（d）术前catwalk步态图
除了做步态分析外，作者还做了扫描电镜和组织学实验，更进一步验证自己的实验。在leo 1450vp扫描电镜图像下，手动标记兴趣区（活性区域）包括新形成的骨和水泥吸收的表面部分，这个在后面具体的电镜数据上来直观地观察这三个部分的变化。
图3，股骨植入后的扫描电镜图像
使用leica qwin pro软件来分析兴趣区，具体是：（a）生物活性区（浅蓝色区域），它包括了（b）新形成的骨头（绿色区域）和（c）*吸收的表面（蓝色区域）。
接下来就是数据结果分析了，首先是catwalk的结果分析：手术前，动物步态正常，与对侧相比，右后腿爪的印纹面积和印纹长度没有显著差异。术前基础参考的平均值为：脚印面面积1.88±0.03 cm2，脚印平均接触强度115.28±0.55 au，脚印长度1.86±0.02cm2，支撑期比重66.34%±0.56%。
图和6a显示的是手术前后脚印面积的变化。cpc组脚印面积从2.04±0.07 cm2手术前的值下降到24小时之后的0.66±0.06 cm2，14天以后逐渐增加到1.60±0.06 cm2。在这两种*中，在术后次减少后，与未加载的cpc在14天时相比，两种均可以更快地恢复到基线值。
术后24小时，*处理大鼠的步态变化达到高水平（从基础值降到低），这说明了cpc-bupi和cpc-ropi组的相比cpc组脚印面积有了显著增加（p＜0.01）：cpc-bupi组1.44±0.06 cm2，cpc-ropi组1.10±0.06 cm2，图5b中脚印图也可以很直观的对应此结果。与此同时，两种水泥之间也是有差异的，cpc-bupi组脚印面积明显大。术后48小时后，两种水泥跟cpc相比，依然有差异，一直持续到第7天，cpc-bupi组恢复到手术前的基础值时才消失。
图5，实验组术后右后爪的脚印面积
(a) cpc组表示为黄色实线，cpc-bupi组蓝色点虚线，pc-ropi组绿色点划线，手术前的参考组黑色虚线。用双因素方差分析，事后分析fisher检验，结果表示为平均值±标准差(n = 6),* p < 0.01 (cpc-bupi vs cpc-ropi vs cpc),** p < 0.01 anesthetic loaded-cpcs vs cpc, # p < 0.01 cpc-bupi vs others；（b）手术后24小时每组脚印面积图
接触强度的结果也是这样（图6b）。术后24小时，与术前基础值相比，cpc组，cpc-bupi和cpc-ropi组分别下降了25%±2%，9%±2%，1%±2%。这三组互相比较都有显著差异（p＜0.01），48小时后，cpc组下降至低（79%±2%），分别与cpc-ropi组（96%±2%）和cpc-bupi组（98%±2%）比较。有趣的是，cpc-ropi组全程跟术前的基础值相比都没有统计差异，这一点很费解。术后第14天，cpc组和cpc-bupi组开始回到基础值，这种差异才消失。
与脚印面积结果一致，脚印长度在术后是降低的（图6c）。24小时后，cpc组脚印长度的值为72%±2%，cpc-bupi组和cpc-ropi组分别为91±2%，88±2%，与cpc组相比这两组都有统计差异（p＜0.01），但是cpc-bupi组和cpc-ropi组本身没差异。7天后，这两组与术前基础值相比也没差异了。
图6，三种*的4种测试参数
（a）术前脚印面积的基础值；（b）术前脚印接触强度的基础值；（c）脚印长度占术前的百分比重；（d）支撑期比重占术前的基础值百分比；cpc组表示为黄色实线，cpc-bupi组蓝色点虚线，pc-ropi组绿色点划线，手术前的参考组黑色虚线。用双因素方差分析，事后分析fisher检验，结果表示为平均值±标准差(n = 6), * p < 0.01 (cpc-bupi vs cpc-ropi vs cpc), ** p < 0.01 loaded-cpcs vs cpc, # p < 0.01 cpc-bupi vs others
支撑期比重在整个手术过程中都没有表现出来差异，这两种水泥组也没有差异。相反，在24小时后，cpc组支撑起比重值降低并且和两种水泥组相比有显著差异（p＜0.01）：cpc组84%±2%，cpc-ropi组95%±2%和cpc-bupi组99%±2%。术后48小时开始差异消失，第7天恢复至术前的值。
结果除了步态分析，还有sem（扫描电镜）和组织学结果分析，可见作者实验设计的严格和缜密，手术3周后，注射植入的*仍然在注射的位置可见，同时新生的骨质层相同位置也能观察到* (图7a)。
不仅如此，所有*均观察到骨样组织与成骨细胞细胞系交界，这说明使用三种不同的*，不影响新生骨质的生长。在所有的*（与骨组织之间），可以看到骨组织被一条由成骨细胞排成的线标记出边沿，这说明不同*中的药物的释放，并没有改变骨质-*界面和骨修复。
上图7为（a）手术后的扫描电镜图像；（b）结果表示为新骨形成相比于兴趣区的百分率
图8术后3周后股骨标本的组织学分析。（a）movat染色法观察全水泥置入后的效果（蓝色=水泥；黄色-绿色=骨，淡粉色=软组织）；（b）movat染色下的新骨形成的详细图像（红线=骨样组织，紫线=成骨细胞细胞株）；（c）苏木素-伊红染色观察骨髓
步态和扫描电镜做完了，作者还不放心，又做了组织学的实验，组织学分析没有发现任何不良炎症反应，(图8)。图8a 显示的是在植入*手术后整个movat’s染色的图（蓝色=水泥；黄色-绿色=骨，淡粉色=软组织） movat染色法能在一张组织切片上确定多种结缔组织成分，能有效的区分软骨的钙化，能明显的区分成骨细胞破骨细胞和其他成分，在研究骨的生长和修复中起关键作用。还有更细节的地方，染色图里的新骨形成图8b（红线=骨样组织，紫线=成骨细胞细胞株），与未加载的cpc相比，药物的局部释放并没有改变加载cpcs的*界面和骨结合，后再来个苏木素-伊红染色看看骨髓的情况。
作者很严谨，后提出了出于动物伦理原因，手术过程中作为麻醉动物用的盐酸丁丙诺非是按先发镇痛作用皮下注射的，半衰期比*还长（大于6小时），所以担心这种*麻醉作用影响catwalk早期阶段的数据，同时手术情况和catwalk实行双盲，也是严谨的另一面。到这里就算做完了，得出结论：本文的意义在于开创了一个用来评价骨重建修复引起的疼痛的指导方法：catwalk步态分析体统从行为上直观直接的测试，并且用了这种cpc材料和局部麻醉剂的结合来研究骨手术术后重建疼痛的缓解，对该领域的研究起到指导和借鉴作用。
参考文献：
1. maharaj mm, phan k, mobbs rj. anterior cervicaldiscectomy and fusion (acdf) autograft versus graft substitutes: what dopatients prefer—a clinical study. j spine surg 2:105-110, 2016.
2. vrinten dh, hamers ff. ‘catwalk’ automated quantitativegait analysis as a novel method to assess mechanical allodynia in the rat; a comparisonwith von frey testing. pain 102:203-209, 2003.
3. coulthard p, pleuvry bj, brewster m, et al. gait analysisas an objective measure in a chronic pain model. j neurosci methods116:197-213, 2002.
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