双染法免疫荧光组织化学染色步骤
如果同一标本中需要同时显示a、b两种抗原，则a抗原的抗体用fitc标记，b抗原的抗体用tritc标记，可采用以下染色方法用过的：
免疫荧光细胞化学双染
原代培养的大鼠端脑细胞第14天胚胎：在成骨形态蛋白的诱导下，乙酰胆碱转移酶（绿色荧光）和同源结构域蛋白islet-1（红色荧光）共存于细胞质中（激光扫描共存）。聚焦显微镜观察）
1.一步双染法，将两种荧光标记抗体按适当比例（a+b）混合，按照直接法进行染色。
2.两步双染法，先用tritc标记的抗体a进行免疫荧光染色，然后用fitc标记的抗体b进行免疫荧光染色。根据两种抗体的动物种类，可以采用直接法或间接法。结果是a抗原呈橙红色荧光，而b抗原呈黄绿色荧光。在应用中，常用的方法是免疫荧光组织化学中的间接法与荧光染料sabc-cy3法的结合。例如，在实验设计中，选择小鼠抗大鼠a和兔抗大鼠b作为两种不同的特异性一抗，匹配的二抗分别为fitc-抗小鼠igg和生物素化抗兔。免疫球蛋白g。
进行双染时，由于两种一抗来源不同，可能会混合一抗。孵育后，清洗未结合的一抗。滴加二抗时，先加入人生物素化抗兔igg（二抗）孵育。清洗后，滴下 sabc-cy3 复合物。特异性荧光，然后与fitc-抗小鼠igg（二抗）孵育，最后封片观察。结果，a抗原显示绿色荧光，b抗原显示红色荧光。
该方法中需要注意的是，两种一抗混合稀释时，抗体的终浓度应为每种抗体的工作浓度。也就是说，混合液要同时满足两种一抗的工作浓度。如果两个一抗来自同一物种，则必须进行两次双染，即a抗原先用第一个一抗和第一个荧光二抗染色，然后用第二个一抗和第一个荧光二抗洗涤荧光二抗。 b抗原染色需使用两种荧光二抗，否则会发生交叉反应，导致染色不特异。
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