百萤-Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 细胞增殖与活性检测试剂盒实验方案
cell counting kit-8 (cck-8)细胞增殖与活性检测试剂盒是百萤生物生产的一种基于 wst-8 的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。百萤生物是aat bioquest中国区域一级代理商，为国内提供 aat 的原装产品及产品定制、技术服务，欢迎咨询、订购！
实验方案
1.在96 孔板中配置100μl的细胞悬液（通常细胞增殖实验每孔加入100μl2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100μl5000个细胞。具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等因素决定)。按照实验需要，进行培养（在37°c，5%co2的条件下）预培养24 小时。
2.向培养板加入1-10μl 不同浓度的待测药物刺激。
3.将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24 或48 小时）。
4.每孔加入10μlcck-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响od 值的读数）。如果起始的培养体积为200μl，则需加入20μlcck-8溶液，其它情况以此类推。可以用加了相应量细胞培养液和cck-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。如果担心所使用的药物会干扰检测，需设置加了相应量细胞培养液、药物和cck-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。
5.在细胞培养箱内继续孵育1-4小时，对于大多数情况孵育1小时就可以了。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定，初次实验时可以在0.5、1、2和4小时后分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。
6.用酶标仪测定在450nm处的吸光度，如无450nm滤光片，可以使用420-480nm的滤光片。可以使用大于600nm的波长，例如650nm，作为参考波长进行双波长测定。
7.如果暂时不测定od 值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10 μl 0.1m 的hcl 溶液或者1% w/v sds 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。
注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加cck 之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
注意事项：
1.由于使用96孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发的问题。一方面，由于96孔板周围一圈容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加pbs，水或培养液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。
2.cck-8检测细胞活性的原理是通过检测活细胞脱氢酶催化的反应。任何待测体系中存在还原剂，例如一些抗氧化剂会干扰检测，需设法去除。
3.建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入cck-8试剂后的培养时间。
4.建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加入cck 试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基液面下加样，容易产生气泡，会干扰od 值读数。
5.当使用标准96 孔板时，贴壁细胞的小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μl培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μl培养基)，且培养时间长一些。如果要使用24 孔板或6 孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入cck-8溶液。
6.加入cck -8溶液时，如果细胞培养时间较长，培养基颜色已变化或ph值变化。建议换用新鲜的培养基。
7.如果没有450nm 的滤光片，可以使用吸光度在430-490 nm 之间的滤光片，但是450nm 滤光片的检测灵敏度最高。
8.酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。
9.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
实验图：
图 2. cck-8 检测细胞活性原理图
相关产品
品名
货号
规格
细胞增殖wst-8检测试剂
#15705/#15706/#15707
25mg/100mg/1g
cell meter 比色法wst-8细胞定量试剂盒
#22770/#22771
1000tests/5000tests
关键词：移液器 培养箱 酶标仪 细胞培养箱
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1.在96 孔板中配置100μl的细胞悬液（通常细胞增殖实验每孔加入100μl2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100μl5000个细胞。具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等因素决定)。按照实验需要，进行培养（在37°c，5%co2的条件下）预培养24 小时。
2.向培养板加入1-10μl 不同浓度的待测药物刺激。
3.将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24 或48 小时）。
4.每孔加入10μlcck-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响od 值的读数）。如果起始的培养体积为200μl，则需加入20μlcck-8溶液，其它情况以此类推。可以用加了相应量细胞培养液和cck-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。如果担心所使用的药物会干扰检测，需设置加了相应量细胞培养液、药物和cck-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。
5.在细胞培养箱内继续孵育1-4小时，对于大多数情况孵育1小时就可以了。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定，初次实验时可以在0.5、1、2和4小时后分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。
6.用酶标仪测定在450nm处的吸光度，如无450nm滤光片，可以使用420-480nm的滤光片。可以使用大于600nm的波长，例如650nm，作为参考波长进行双波长测定。
7.如果暂时不测定od 值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10 μl 0.1m 的hcl 溶液或者1% w/v sds 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。
注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加cck 之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
注意事项：
1.由于使用96孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发的问题。一方面，由于96孔板周围一圈容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加pbs，水或培养液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。
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3.建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入cck-8试剂后的培养时间。
4.建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加入cck 试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基液面下加样，容易产生气泡，会干扰od 值读数。
5.当使用标准96 孔板时，贴壁细胞的小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μl培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μl培养基)，且培养时间长一些。如果要使用24 孔板或6 孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入cck-8溶液。
6.加入cck -8溶液时，如果细胞培养时间较长，培养基颜色已变化或ph值变化。建议换用新鲜的培养基。
7.如果没有450nm 的滤光片，可以使用吸光度在430-490 nm 之间的滤光片，但是450nm 滤光片的检测灵敏度最高。
8.酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。
9.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
实验图：
图 2. cck-8 检测细胞活性原理图
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