由赭曲霉(aspergiltus ochratoxin)和硫色曲霉(a.sulphureus)等产生的赭曲霉毒素(ochratoxin)有a、b、c、d 四种化合物。其中,赭曲霉毒素a(ochratoxin a,ota)是重具卫生学意义的霉菌代谢产物。赭曲霉毒素a 是一种强致死性化合物,它会导致肝、肾坏死性病变。对雏鸭经口测试, ld50 仅为0.5mg/kg体重,其毒性与黄曲霉素相当。在肝癌高发区的谷物中可分离出赭曲霉素。赭曲霉素a 的污染范围较广,几乎可污染玉米,小麦等所有的谷物和中药材。
目前已有粮食和食品中赭曲霉毒素a 的检验标准。本文以薏苡仁、淡豆豉和白扁豆为基质,发展赭曲霉毒素a 的前处理和分离检测方法,以期对同类型的检测提供参考。
样品前处理
提取液
甲醇:水 (8:2, v:v)。
pbs 溶液
称取8 g 氯化钠、1.2 g *、0.2 g 磷酸二氢钾,溶解于990 ml 水中,用浓盐酸调节ph 7,用水稀释至1 l。
清洗液缓冲
称取25 g 氯化钠、5 g *溶于水中,加入0.1 ml 吐温-20,用水稀释至1 l。称取15 g 中药样品加入到50 ml 离心管中,加入30 ml 提取液,加入0.75 g氯化钠,振摇后涡旋3 min,超声20 min,中间振摇3 次,11000 r/min 离心15 min后取上清液。取2 ml 上清液, 氮吹除去大部分的甲醇后,用pbs 溶液定容到10ml,过0.22 um 滤膜。取过滤后的提取液5 ml,以1 滴每3 秒流速流过免疫亲和柱,然后2~4 ml 空气排空,10 ml 清洗缓冲液、10 ml 水依次淋洗免疫亲和柱,弃去淋洗液,抽干小柱。1.5 ml 甲醇洗脱,40 ℃下氮气吹干,用流动相定容至1 ml,供检测。
测试用对照品的配制
使用流动相将10 mg/l 的赭曲霉毒素a 标准溶液依次稀释成3.13 μg/l、6.25μg/l、12.50 μg/l、25.00 μg/l、50.00 μg/l、100.00 μg/l 和200.00 μg/l 的线性标准溶液。
色谱条件
色谱柱(货号):acclaim c18
4.6×150 mm,5 μm(货号:059148)
流动相:乙腈:水:冰醋酸 (48:51:1, v:v:v)
流速:1ml/min
检测器:荧光,ex: 333nm;em: 460nm
柱温:30℃
进样量:20μl
仪器:ultimate 3000
实验谱图
1
线性
图1 线性叠加谱图(从低到高依次代表浓度为3.13 μg/l、6.25 μg/l、12.50 μg/l、25.00 μg/l、50.00μg/l、100.00 μg/l 和200.00 μg/l 的ota 标准溶液)
图2 ota 标准曲线图
表1 赭曲霉毒素a 线性曲线
名称 线性曲线
ota a = 6166c + 12898,r² = 1.000
2
重复性
图3 低浓度样品(3.13 μg/l ota)重复性
表2 低浓度样品进样重复性
名称 保留时间 rsd% 峰面积 rsd% 样品浓度(μg/l)
ota 0.09% 0.67 % 3.13
图4 高浓度样品(200 μg/l ota)重复性
表3 高浓度样品进样重复性
名称 保留时间 rsd% 峰面积 rsd% 样品浓度(μg/l)
ota 0.01% 0.11% 200
实验数据
检出限和定量限
图5 检出限 (0.15 μg/l ota)谱图与空白叠加谱图
图6 定量限 (0.55 μg/l ota)谱图与空白叠加谱图
表4 赭曲霉毒素a 的lod 和loq
名称 保留时间(min)
lod(s/n=3)
(μg/l)
loq(s/n=10)
(μg/l)
ota 9.05 0.15 0.55
回收率
图7 薏苡仁加标回收
1- 薏苡仁样品加标; 2-赭曲霉毒素a 对照品; 3-薏苡仁样品
图8 淡豆豉加标回收
1-淡豆豉样品加标; 2-赭曲霉毒素a 对照品; 3 淡豆豉样品
图9 白扁豆加标回收
1-白扁豆样品加标; 2-赭曲霉毒素a 对照品; 3-白扁豆样品
表5 回收率数据
名称 加标量(μg/l) 加标回收率(%)
薏苡米 2.5 99.8
淡豆豉 2.5 100.2
白扁豆 2.5 97.4
结论
本文参考《snt 1940-2007 进出口食品中赭曲霉毒素a 的测定方法》、《snt1746-2006 进出口大豆、油菜籽和食用植物油中赭曲霉毒素a 的检验方法》和《方法报告-2013-app-rlc-058-免疫亲和液相荧光法测定饲料中的赭曲霉毒素a》发展赭曲霉毒素a 测定的方法。以赭曲霉毒素a 对照品为样品,考察了液相方法的检测限、检出限和线性范围。以薏苡仁、白扁豆和淡豆豉为基质,考察了前处理方法的净化能力和基质干扰情况。结果表明,该前处理方法回收率高、具有较好的净化能力,赭曲霉毒素a 出峰位置附近无干扰峰,可用于薏苡仁、白扁豆和淡豆豉赭曲霉毒素a 的检测。液相方法重复性好、具有较宽的线性范围、较低的检测限和检出限。
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