Vaspin靶向AMPK信号通路通过GRP78受体减轻脂肪变性诱导的纤维化
非酒精性脂肪性肝病 （nafld） 是一种多因素疾病，通常与肥胖、2型糖尿病（t2d）、高脂血症和代谢综合征有关。虽然参与nafld发展的确切分子机制尚不清楚，但肝细胞ffa（游离脂肪酸）积累和脂毒性与几个基因功能有关，这些基因功能增加ffa摄取（如caveolin-1和fabp4）和脂肪生成（如fas，scd-1和srebp-1c）并减少脂肪酸β-氧化（如cpt1和mcad）和分泌（如apob100）。已经证明，caveolin-1 和 fabp4 蛋白水平与脂肪变性、炎症和纤维化的严重程度相关。srebp1c是成脂基因（包括fas）表达的主要转录因子，在维持静息状态的肝星状细胞（hsc）的纤维化机制中起主要作用。cpt1位于线粒体外膜，促进脂肪酸进入线粒体进行β-氧化并降低cpt1，导致ros生成和炎症。此外，apob100是肝细胞vldl（极低密度脂蛋白）分泌和维持脂质稳态的关键成分。
这些基因的表达水平主要受 5′ amp 活化蛋白激酶 （ampk） 活性的影响。增加细胞amp/atp比值刺激ampk磷酸化，抑制脂肪酸（fa）的重新合成，激活fa氧化，并通过抑制细胞因子诱导的核因子-κb（nf-κb）的产生来诱导抗炎作用。已有研究表明，含pyrin结构域nod样受体家族3（nlrp3）的炎症小体的激活与肝脂肪变性的进展密切相关。nlrp3炎症小体无疑是代谢炎症和肝纤维化的重要介质。
内脏脂肪组织来源的丝氨酸蛋白酶抑制剂（vaspin）是由脂肪细胞、肝细胞和其他几种组织释放的脂肪因子，由于其改善胰岛素抵抗和抗动脉粥样硬化的能力而受到广泛关注，它在激活各种信号通路中起主要作用。vaspin可作为内皮细胞和卵巢细胞以及活化的蛋白激酶a（pka）信号通路中grp78受体的配体。也有报道称，vaspin与肝脂肪变性以及纤维化进展密切相关。
鉴于没有关于vaspin对脂肪变性和肝纤维化发展中细胞代谢影响的分子机制研究，伊朗库尔德斯坦医科大学研究团队曾试图详细阐明vaspin对相关基因、信号通路和炎症标志物表达的可能影响，还使用具有hepg2（人肝癌细胞系）和lx-2（人肝星形细胞）细胞系的nafld细胞模型研究了纤维化相关过程。
细胞内脂质积累和细胞活力测定
为了研究脂肪变性的细胞模型，使用荧光显微镜和流式细胞术观察并确认了ffa积累。结果表明，与对照组相比，细胞内ffa含量增加了（27.9%）。然后使用mtt测量ffa处理的细胞的活力以及hepg2细胞的vaspin的活性。结果表明，在用 1.2 mm ffa 和 50、100 和 300 ng/ml vaspin 处理的细胞中未观察到与处理相关的细胞死亡。在共培养的hepg2 + lx-2细胞系中也观察到了类似的结果。
vaspin对ffa处理的hepg2细胞系中caveolin-1、fabp4和apob100基因表达的影响
vaspin改变了ffa处理的hepg2细胞系中caveolin-1、fabp4和apob100的表达水平。图1显示，与未处理组相比，ffa处理的细胞中基因表达显著增加。24 小时后，vaspin（50、100、300 ng/ml）显著降低caveolin-1表达，并降低fabp4基因表达，但这些变化不显著。apob100的表达水平较对照组显著升高。用1:2000稀释的grp78-ab溶液处理细胞从而抑制grp78受体，这显著阻断了三种浓度下vaspin对caveolin-1和apob100表达水平的影响。
图1 50、100、300 ng/ml vaspin处理和阻断grp78受体对相关fa摄取和分泌基因表达的影响。vaspin降低了ffa处理的hepg2细胞系中的caveolin-1，apob100表达。通过单独rt-qpcr并与ffa处理的hepg2细胞系中的grp78-ab共处理24 h 分析vaspin对caveolin-1，fabp4和apob100基因表达的影响。
vaspin降低了ffa处理的hepg2细胞系中的scd-1、fas和srebp-1c表达
接下来实验评估了参与脂肪生成的scd-1，fas和srebp-1c的基因表达。ffa处理24小时后，3种基因的表达水平均显著升高。与对照组相比，用vaspin处理逆转了scd-1，srebp-1c（在所有三种浓度下）和fas（100 ng/ml）的这种表达。
与vaspin 相同浓度的处理相比，vaspin与grp78-ab的联合处理显著逆转了scd-1和srebp-1c表达的降低。在fas基因表达中，与相同浓度的vaspin单独处理相比，同时用vaspin和grp78-ab处理细胞没有观察到显著增加。
vaspin增加了ffa处理的hepg2细胞系中的cpt1和mcad表达
为了研究vaspin抑制肝脏脂肪变性的机制，实验测量了参与肝β-氧化的关键基因的表达，包括cpt1和mcad。ffa处理24小时后cpt1和mcad基因表达下降，对mcad有统计学意义。所有浓度的vaspin均显著增加mcad的表达，而100 ng/ml浓度显著增加cpt1的表达。但是当细胞同时用vaspin和grp78-ab处理时，这些表达的升高在cpt1（100 ng/ml 下）和mcad（所有浓度下）中得到显著抑制（图2）。
图2 vaspin增加ffa处理的hepg2细胞系中cpt1和mcad基因的表达。通过rt-qpcr 分析并与ffa 处理的 hepg2 细胞系中 grp78 ab 共处理24 h 分析50、100、300 ng/ml vaspin 对cpt1和 mcad 基因的影响。
vaspin在ffa处理的hepg2中增加ampk活性
实验还研究了vaspin对ampk活性的刺激作用。与对照组相比，浓度为50、100和300 ng/ml的vaspin处理的细胞在24小时内显著增加ampk活性。与相同浓度的vaspin相比，用vaspin和grp78-ab共同处理细胞抑制了这种升高，并在50和100 ng/ml浓度下显著降低了ampk的活性。
vaspin降低了hepg2和lx-2细胞系共培养纤维化模型中nf-κb和tgf-β1的表达
与ffa处理的细胞相比，ffa和100 ng/ml vaspin同时处理共培养的hepg2和lx-2细胞显著降低了nf-κb和tgf-β1表达（图3 a、b）。与ffa处理的细胞相比，mcc950（nlrp3抑制剂）处理组nf-κb和tgf-β1的基因表达也降低（图3 a、b）。值得注意的是，vaspin在降低tgf-β1表达方面比mcc950更有效（图3 b）。研究发现，与vaspin和mcc950组的个体效应相比，vaspin和mcc950的共同处理显著降低了tgf-β1和nf-κb的基因表达。这表明vaspin+mcc950具有协同作用（图3 a、b）。
图3 vaspin降低了ffa处理的hepg2和lx-2细胞系中的nf-κb和tgf-β1基因表达。通过rt-qpcr分析mcc950，100 ng/ml vaspin和vaspin+mcc950对hepg2和lx-2共培养细胞中nf-κb和tgf-β1基因的影响。
vaspin降低了hepg2和lx-2细胞系共培养纤维化模型中tgf-β1和α-sma的蛋白质水平
与各自的对照组相比，vaspin（100 ng/ml）显著降低了ffa处理（96小时）的共培养的hepg2和lx-2细胞中tgf-β1和α-sma的蛋白质水平（图4 b、c）。同样，与ffa处理组相比，mcc950处理组的tgf-β1和α-sma蛋白显著减弱。这一结果表明，与mcc950相比，vaspin在降低tgf-β1方面比α-sma具有更强的潜在作用。
图4 vaspin可减轻共培养的ffa处理的hepg2和lx-2细胞系中的肝纤维化。hepg2和lx-2共培养的细胞用mcc950，100 ng/ml vaspin 和vaspin+mcc950处理。通过蛋白质印迹分析tgf-β1和α-sma蛋白水平。
总之，该研究的数据表明，vaspin减少了细胞模型中的炎症和纤维化。实验观察到，vaspin通过降低参与脂肪生成和fa摄取的基因表达，同时通过grp78受体和ampk信号通路增加氧化和fa分泌，从而减少了肝细胞中的fa积累。这表明 vaspin 可被视为肝纤维化的潜在抗脂肪变性和抗纤维化剂。
参考文献：abdolahi a, vahabzadeh z, izadpanah e, moloudi mr. vaspin attenuates steatosis-induced fibrosis via grp78 receptor by targeting ampk signaling pathway. j physiol biochem. 2022 feb;78(1):185-197. doi: 10.1007/s13105-021-00852-7. epub 2022 jan 10. pmid: 35001345.
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【SPM9513】
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这些基因的表达水平主要受 5′ amp 活化蛋白激酶 （ampk） 活性的影响。增加细胞amp/atp比值刺激ampk磷酸化，抑制脂肪酸（fa）的重新合成，激活fa氧化，并通过抑制细胞因子诱导的核因子-κb（nf-κb）的产生来诱导抗炎作用。已有研究表明，含pyrin结构域nod样受体家族3（nlrp3）的炎症小体的激活与肝脂肪变性的进展密切相关。nlrp3炎症小体无疑是代谢炎症和肝纤维化的重要介质。
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细胞内脂质积累和细胞活力测定
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vaspin对ffa处理的hepg2细胞系中caveolin-1、fabp4和apob100基因表达的影响
vaspin改变了ffa处理的hepg2细胞系中caveolin-1、fabp4和apob100的表达水平。图1显示，与未处理组相比，ffa处理的细胞中基因表达显著增加。24 小时后，vaspin（50、100、300 ng/ml）显著降低caveolin-1表达，并降低fabp4基因表达，但这些变化不显著。apob100的表达水平较对照组显著升高。用1:2000稀释的grp78-ab溶液处理细胞从而抑制grp78受体，这显著阻断了三种浓度下vaspin对caveolin-1和apob100表达水平的影响。
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vaspin降低了ffa处理的hepg2细胞系中的scd-1、fas和srebp-1c表达
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与vaspin 相同浓度的处理相比，vaspin与grp78-ab的联合处理显著逆转了scd-1和srebp-1c表达的降低。在fas基因表达中，与相同浓度的vaspin单独处理相比，同时用vaspin和grp78-ab处理细胞没有观察到显著增加。
vaspin增加了ffa处理的hepg2细胞系中的cpt1和mcad表达
为了研究vaspin抑制肝脏脂肪变性的机制，实验测量了参与肝β-氧化的关键基因的表达，包括cpt1和mcad。ffa处理24小时后cpt1和mcad基因表达下降，对mcad有统计学意义。所有浓度的vaspin均显著增加mcad的表达，而100 ng/ml浓度显著增加cpt1的表达。但是当细胞同时用vaspin和grp78-ab处理时，这些表达的升高在cpt1（100 ng/ml 下）和mcad（所有浓度下）中得到显著抑制（图2）。
图2 vaspin增加ffa处理的hepg2细胞系中cpt1和mcad基因的表达。通过rt-qpcr 分析并与ffa 处理的 hepg2 细胞系中 grp78 ab 共处理24 h 分析50、100、300 ng/ml vaspin 对cpt1和 mcad 基因的影响。
vaspin在ffa处理的hepg2中增加ampk活性
实验还研究了vaspin对ampk活性的刺激作用。与对照组相比，浓度为50、100和300 ng/ml的vaspin处理的细胞在24小时内显著增加ampk活性。与相同浓度的vaspin相比，用vaspin和grp78-ab共同处理细胞抑制了这种升高，并在50和100 ng/ml浓度下显著降低了ampk的活性。
vaspin降低了hepg2和lx-2细胞系共培养纤维化模型中nf-κb和tgf-β1的表达
与ffa处理的细胞相比，ffa和100 ng/ml vaspin同时处理共培养的hepg2和lx-2细胞显著降低了nf-κb和tgf-β1表达（图3 a、b）。与ffa处理的细胞相比，mcc950（nlrp3抑制剂）处理组nf-κb和tgf-β1的基因表达也降低（图3 a、b）。值得注意的是，vaspin在降低tgf-β1表达方面比mcc950更有效（图3 b）。研究发现，与vaspin和mcc950组的个体效应相比，vaspin和mcc950的共同处理显著降低了tgf-β1和nf-κb的基因表达。这表明vaspin+mcc950具有协同作用（图3 a、b）。
图3 vaspin降低了ffa处理的hepg2和lx-2细胞系中的nf-κb和tgf-β1基因表达。通过rt-qpcr分析mcc950，100 ng/ml vaspin和vaspin+mcc950对hepg2和lx-2共培养细胞中nf-κb和tgf-β1基因的影响。
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与各自的对照组相比，vaspin（100 ng/ml）显著降低了ffa处理（96小时）的共培养的hepg2和lx-2细胞中tgf-β1和α-sma的蛋白质水平（图4 b、c）。同样，与ffa处理组相比，mcc950处理组的tgf-β1和α-sma蛋白显著减弱。这一结果表明，与mcc950相比，vaspin在降低tgf-β1方面比α-sma具有更强的潜在作用。
图4 vaspin可减轻共培养的ffa处理的hepg2和lx-2细胞系中的肝纤维化。hepg2和lx-2共培养的细胞用mcc950，100 ng/ml vaspin 和vaspin+mcc950处理。通过蛋白质印迹分析tgf-β1和α-sma蛋白水平。
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