原位杂交组织化学实验操作步骤简单介绍
组织取材：
组织取材应尽可能新鲜。由于组织rna降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30min内固定。
固定目：
①保持细胞结构；
②最大限度地保持细胞内dna或rna的水平；
③使探针易于进入细胞或组织。
常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。
增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：
稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10 min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。组织和细胞标本亦可用0.2 m hcl处理10 min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。
去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是triton x-100。注意：过度的去污剂处理不仅影响组织的形态结构，而且还会引起靶核酸的丢失。
蛋白酶处理：蛋白酶消化能使经固定后被遮蔽的靶核酸暴露，以增加探针对靶核酸的可及性。
杂交缓冲液孵育：
杂交前用不含探针的杂交缓冲液在杂交温度下孵育2hr，以阻断玻片和标本中可能与探针产生非特异性结合的位点，达到减低背景的目的。
防止污染：
由于在手指皮肤及实验室用玻璃器皿上均可能含有rna酶，为防止其污染影响实验结果，在整个杂交前处理过程中都需要戴消毒手套，实验所用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温烘烤（180℃）以达到消除rna酶的目的。杂交前及杂交时所用的溶液均需经高压消毒处理。
双链dna探针和靶dna的变性：
杂交反应进行时，探针和靶核酸都必须是单链的。如果用双链dna探针进行杂交（包括检测rna时），双链dna探针在杂交前必须进行变性。探针变性后要立即进行杂交反应，不然解链的探针又会重新复性。
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固定目：
①保持细胞结构；
②最大限度地保持细胞内dna或rna的水平；
③使探针易于进入细胞或组织。
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增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：
稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10 min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。组织和细胞标本亦可用0.2 m hcl处理10 min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。
去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是triton x-100。注意：过度的去污剂处理不仅影响组织的形态结构，而且还会引起靶核酸的丢失。
蛋白酶处理：蛋白酶消化能使经固定后被遮蔽的靶核酸暴露，以增加探针对靶核酸的可及性。
杂交缓冲液孵育：
杂交前用不含探针的杂交缓冲液在杂交温度下孵育2hr，以阻断玻片和标本中可能与探针产生非特异性结合的位点，达到减低背景的目的。
防止污染：
由于在手指皮肤及实验室用玻璃器皿上均可能含有rna酶，为防止其污染影响实验结果，在整个杂交前处理过程中都需要戴消毒手套，实验所用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温烘烤（180℃）以达到消除rna酶的目的。杂交前及杂交时所用的溶液均需经高压消毒处理。
双链dna探针和靶dna的变性：
杂交反应进行时，探针和靶核酸都必须是单链的。如果用双链dna探针进行杂交（包括检测rna时），双链dna探针在杂交前必须进行变性。探针变性后要立即进行杂交反应，不然解链的探针又会重新复性。
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