动物食品中地xi泮及安mian酮的检测-赛默飞气相色谱-质谱法
概述】
地xi泮(diazepam)、安mian酮(methaqualone)在临床上作为镇静cui眠药，属于精神管制药,*服用有成瘾性和依赖性。
近年来,随着畜牧养殖业的发展,有不法分子在经济利益的驱动下,擅自在畜禽饲养中添加使用以期增加产肉量。地xi泮、安mian酮在饲料中的滥用,将终导致畜产品中药物的残留,从而严重影响消费者的身体健康[1]。
地xi 泮、安mian酮的测定方法多集中在临床制药和刑侦检测方面,如血液、尿液、胃内容物等。主要有紫外分光光度法检测;液液提取,用hplc分析;固相萃取,gc-fid或gc-ms测定;用薄层层析分离定性,用薄层扫描测定含量[1～3]。
【实验/设备条件】
色谱柱：tg-5ms（30 m×0.25 mm×0.25μm）；
柱温：150℃（1 min），10℃/min到290℃（4 min）；
进样模式：不分流进样；进样量：1 µl，分流时间1 min；
进样口温度：290℃（15 min）；
载气：氦气（99.999%），恒流模式，1 ml/min；
质谱离子源温度：310℃，传输线温度：290℃；
扫描模式：选择离子监测模式，每个离子驻留时间0.09 s，
地xi 泮：283,256*,241,221；安mian酮：250, 235*, 217,91；
【样品提取】
提取
取适量新鲜的猪肉样品，用匀浆机绞碎，并使均质。取均质后的供试样品，作为供试材料，空白样品作为空白试料；均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为加标回收材料。
称取试料约1.0 g(到0.01 g)，于15 ml离心管中，加入10 ml乙腈，涡旋后水浴超声5 min，8000 r/min离心10 min，取上清液于50 ml离心管中，加入30 ml正己烷，涡旋混匀后静置，弃上层液。取下层液，于50℃氮气吹至1 ml，加水4 ml，混匀备用。
净化
c18柱依次用甲醇5 ml和水5 ml活化，取备用液过柱，用50%甲醇水溶液5 ml淋洗，用70%甲醇水溶液5 ml洗脱，收集洗脱液，于50℃氮气吹干，用200μl甲醇复溶，待测。
【实验/操作方法】
本方法是将样品中的地xi泮和安mian酮用乙腈提取，固相萃取的方法净化后用气相色谱-质谱进行定性、定量。该方法定量准确，灵敏度高，重现性好，能够满足目前动物性食品中地xi泮和安mian酮检测的需要。
【实验结果/结论】
仪器分析方法优化：以全扫描的方式对目标物标液进行测定，得到其质谱图，根据全扫描质谱图经nist谱库检索进一步确证目标化合物，得到其保留时间，选择合适的定性和定量的特征目标监测离子。测定时，可根据标准物和待测物的定量离子图中的峰面积，外标法定量。确证时，可根据碎片离子及其丰度比作为其阳性判别的依据。在选定的色谱条件下，标准品的色谱图见图1。
图 1.由上至下分别为甲醇空白、10 ng/ml标准溶液及基质空白的提取离子图
线性关系及测定低限：将0.5、1、5、10、50、100、500和1000 ng/ml的系列标准工作液由低浓度到高浓度进样。
以测定峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线如图2，表1.。分别将样品前处理项下的加标回收样品，按照样品前处理步骤处理，所得的溶液进样即得各组分的加标回收率，具体见表2、表3.。本实验方法检出限以3倍信噪比计算得到，本方法测定猪肉中安mian酮和地xi泮的的测定低限为1.0 µg/kg。
图2.安mian酮（左）和地xi泮（右）的标准曲线
表1.标准曲线结果
表2.安mian酮的加标回收率（n=5）
表3.地xi泮的加标回收率（n=5，本底检出38.55ng/ml）
图3.由上至下分别为低、中、高浓度的加标回收率谱图
回收率及精密度实验：用标准添加法，在均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为加标回收材料。按上述方法进行提取、净化和测定，猪肉样品中各目标物的添加浓度均为 10 ng/ml、50 ng/ml和100 ng/ml 三个水平，每个浓度点平行 5 份，各添加谱图见图3，低浓度（10 ng/ml）各组分选择离子质谱图和标样质谱图见图4，5.。由图4和图5的对比可以看出尽管在低浓度地xi泮周围杂峰较多，但是其离子比例仍然与标样接近，符合定性要求。回收率具体结果见表2、3.。
图4. sim模式下标准溶液10 ng/ml的质谱图
图5. sim模式下加标回收率溶液10 ng/ml的质谱图
结论
本实验参考食品安全标准gb29697-2013,采用气质联用检测猪肉组织中的地xi泮和安mian酮，方法灵敏，结果可靠，可以为动物食品中的地xi泮和安mian酮的检测提供参考。
【仪器/耗材清单】
仪器
trace1310-isq气相色谱质谱联用仪，配ei源（thermoscientific）；
as1310自动进样器（thermo scientific）
恒温水浴锅、离心机、天平、漩涡混合器、氮吹仪、固相萃取仪（thermo scientific）。
耗材
色谱柱：tg-5silms（30 m×0.25 mm×0.25μm）（thermo scientific,pn: 26096-1421）c18 spe柱，500 mg，3ml（thermo scientific）
试剂与标准品
地xi泮和安mian酮标准储备溶液：浓度200μg/ml；
正己烷、乙腈、甲醇：色谱chun(thermofisher)。
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地xi 泮、安mian酮的测定方法多集中在临床制药和刑侦检测方面,如血液、尿液、胃内容物等。主要有紫外分光光度法检测;液液提取,用hplc分析;固相萃取,gc-fid或gc-ms测定;用薄层层析分离定性,用薄层扫描测定含量[1～3]。
【实验/设备条件】
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柱温：150℃（1 min），10℃/min到290℃（4 min）；
进样模式：不分流进样；进样量：1 µl，分流时间1 min；
进样口温度：290℃（15 min）；
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质谱离子源温度：310℃，传输线温度：290℃；
扫描模式：选择离子监测模式，每个离子驻留时间0.09 s，
地xi 泮：283,256*,241,221；安mian酮：250, 235*, 217,91；
【样品提取】
提取
取适量新鲜的猪肉样品，用匀浆机绞碎，并使均质。取均质后的供试样品，作为供试材料，空白样品作为空白试料；均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为加标回收材料。
称取试料约1.0 g(到0.01 g)，于15 ml离心管中，加入10 ml乙腈，涡旋后水浴超声5 min，8000 r/min离心10 min，取上清液于50 ml离心管中，加入30 ml正己烷，涡旋混匀后静置，弃上层液。取下层液，于50℃氮气吹至1 ml，加水4 ml，混匀备用。
净化
c18柱依次用甲醇5 ml和水5 ml活化，取备用液过柱，用50%甲醇水溶液5 ml淋洗，用70%甲醇水溶液5 ml洗脱，收集洗脱液，于50℃氮气吹干，用200μl甲醇复溶，待测。
【实验/操作方法】
本方法是将样品中的地xi泮和安mian酮用乙腈提取，固相萃取的方法净化后用气相色谱-质谱进行定性、定量。该方法定量准确，灵敏度高，重现性好，能够满足目前动物性食品中地xi泮和安mian酮检测的需要。
【实验结果/结论】
仪器分析方法优化：以全扫描的方式对目标物标液进行测定，得到其质谱图，根据全扫描质谱图经nist谱库检索进一步确证目标化合物，得到其保留时间，选择合适的定性和定量的特征目标监测离子。测定时，可根据标准物和待测物的定量离子图中的峰面积，外标法定量。确证时，可根据碎片离子及其丰度比作为其阳性判别的依据。在选定的色谱条件下，标准品的色谱图见图1。
图 1.由上至下分别为甲醇空白、10 ng/ml标准溶液及基质空白的提取离子图
线性关系及测定低限：将0.5、1、5、10、50、100、500和1000 ng/ml的系列标准工作液由低浓度到高浓度进样。
以测定峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线如图2，表1.。分别将样品前处理项下的加标回收样品，按照样品前处理步骤处理，所得的溶液进样即得各组分的加标回收率，具体见表2、表3.。本实验方法检出限以3倍信噪比计算得到，本方法测定猪肉中安mian酮和地xi泮的的测定低限为1.0 µg/kg。
图2.安mian酮（左）和地xi泮（右）的标准曲线
表1.标准曲线结果
表2.安mian酮的加标回收率（n=5）
表3.地xi泮的加标回收率（n=5，本底检出38.55ng/ml）
图3.由上至下分别为低、中、高浓度的加标回收率谱图
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图4. sim模式下标准溶液10 ng/ml的质谱图
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结论
本实验参考食品安全标准gb29697-2013,采用气质联用检测猪肉组织中的地xi泮和安mian酮，方法灵敏，结果可靠，可以为动物食品中的地xi泮和安mian酮的检测提供参考。
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