菌落 PCR 分析克隆的重组体实验
菌落 pcr 分析克隆的重组体实验试剂、试剂盒溴化乙锭taq 延伸 pcr 添加剂tween2010% 溶液dntp 溶液pcr 缓冲液热稳定 dna 聚合酶引物
仪器、耗材无菌枪头琼脂糖凝胶电泳设备和试剂
实验步骤一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
溴化乙锭
taq 延伸 pcr 添加剂（stratagene)
tween20，10% 溶液
2. 酶和酶缓冲液
dntp 溶液（包含所有的 4 种 dntp，每种都是 25 mmol/l)
pcr 缓冲液，10x, 用户买热稳定聚合酶时公司一并提供，或者 pcr 优化缓冲液，比如，opti-prime pcr 优化试剂盒（stratagene)，以及 pcr optimizer(invitrogen)
热稳定 dna 聚合酶（5~10u)，比如，taq dna 聚合酶，克隆化的 pfudna 聚合酶(stratagene)
3. 核酸和寡核苷酸
可选择：插入物特异的引物（在双向克隆中用来确定插入物的方向）
一套筛选重组体的引物
4. 设备
用于划板和接菌的无菌枪头
用枪头代替牙签，是因为牙签可通过毛细作用带走液体，因此会改变反应混合物的浓度。
5. 額外项目
琼脂糖凝胶电泳设备和试剂，包括溴化乙锭
二、方法
1. 根据反应数目或要做的 pcr 反应的管数，在冰上用一个离心管像调鸡尾酒一样准备
pcr「鸡尾酒」式混合物，按如下顺序依次加入各种成分。
h2o 将终体积补充到 25ul
taq 缓冲液，10x 2.5ul
tween20(体积分数 10% 溶液） 1.0ul
dntp 混合物（每种 dntp 为 25 mmol/l) 0.2ul
重组体筛选引物套（100ng/ul) 1ul
taq 延伸 pcr 添加剂（5u/ul) 0.25ul
taq dna 聚合酶（5u/ul) 0.25ul
2. 在冰上，分装鸡尾酒式 pcr 混合物到每一个 pcr 试管中，每管移取 25ul。
3. 对照反应中，加入 1ul 的非重组 dna。
可以选择：对于用来确定插入方向的反应，向恰当的反应管中加入第三个插入物特异的引物。
4. 对于重组筛选，用一个无菌枪头刺挑一下转化后长出的菌落，然后在相应的反应管中搅动菌落物质。在给每一个反应混合物接种后，迅速地移走枪头，并在含有抗生素平板上轻涂以留菌种，以备后续分析。对于 pcr 介导的重组筛选，也可参考下面的疑难解答。
5. 轻轻混匀每个反应体系。
6. 用*的循环参数进行 pcr。
7. 用标准的琼脂糖凝胶电泳分析 pcr 产物。*用 10~15 g/l 琼脂糖凝胶来优化分辨500~6000bp 的 pcr 产物。通常，取 1~5ul pcr 产物经溴化乙锭染色后分析。可以通过传统的瞬间成像技术或计算机图像软件来获取图像。
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2. 在冰上，分装鸡尾酒式 pcr 混合物到每一个 pcr 试管中，每管移取 25ul。
3. 对照反应中，加入 1ul 的非重组 dna。
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4. 对于重组筛选，用一个无菌枪头刺挑一下转化后长出的菌落，然后在相应的反应管中搅动菌落物质。在给每一个反应混合物接种后，迅速地移走枪头，并在含有抗生素平板上轻涂以留菌种，以备后续分析。对于 pcr 介导的重组筛选，也可参考下面的疑难解答。
5. 轻轻混匀每个反应体系。
6. 用*的循环参数进行 pcr。
7. 用标准的琼脂糖凝胶电泳分析 pcr 产物。*用 10~15 g/l 琼脂糖凝胶来优化分辨500~6000bp 的 pcr 产物。通常，取 1~5ul pcr 产物经溴化乙锭染色后分析。可以通过传统的瞬间成像技术或计算机图像软件来获取图像。
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