H9人胚胎干细胞培养方法
h9细胞背景简介h9(别名wa09)人胚胎干细胞，1998年由美国干细胞学家詹姆斯·汤姆森博士建立，取自早期胚胎内细胞团。细胞在培养时呈克隆状，贴壁生长。该细胞不需要饲养层细胞支持，用干细胞专用matrigel基质胶包被培养器皿即可。hesc(h9)细胞株来源于人胚胎干细胞，贴壁生长，呈克隆状，可在hesc/ipsc complete medium中快速增殖，而边缘分化的细胞则在该培养基中生长较慢，从而选择性扩增并获得高纯度人多能干细胞。
h9人胚胎干细胞特征h9人胚胎干细胞系是国际上通用胚胎干细胞系之一，该细胞是从人类早期胚胎内细胞团分离出来，具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。可为细胞遗传发育以及疾病模型研究提供丰富的实验材料。
h9人胚胎干细胞形态
h9人胚胎干细胞荧光检测
h9人胚胎干细胞培养操作
1)h9人胚胎干细胞复苏方法(以6孔板为例)
1. 将水浴锅预热至37℃，并将matrigel包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温(15~30℃)。
2. 取4 ml hesc/ipsc complete medium，按照1:4000比例加入1 μl的hesc/ipsc supplement c，恢复至室温(15~30℃)。
注意：不要在37℃水浴锅中预温培养基。
3. 取出1支冷冻的细胞置于37℃水浴锅手持轻轻摇晃，2 min内解冻，肉眼观察细胞悬液内冰晶即将消失时取出。
4. 75%酒精无尘纸擦拭冻存管表面，转入生物安全柜；将细胞悬液移到事先准备好的15 ml 离心管中，随后缓慢逐滴加入10ml dmem/f12，过程中轻柔晃动混匀细胞，160g离心5 min。
5. 吸弃上清，加入预温的4 ml的hesc/ipsc complete medium+hesc/ipsc supplement c制备细胞悬液，尽量避免吹打。
注：可留20 μl上清液，轻弹管底，使细胞悬浮液更均匀，避免成较大细胞团。
6. 吸除6孔板中2孔的matrigel包被液，将细胞悬液按照2 ml/孔接种到1个孔中。
7. 水平十字摇匀三次，置于37℃，5% co2浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀三次培养。
8. 18-24小时后换新的hesc/ipsc complete medium，之后每天更换培养基。
注：在hesc培养过程中，如果细胞的汇合度超过50%，建议更换培养基时，培养基的体积增加至3-4ml/孔。
2)h9人胚胎干细胞传代方法(以6孔板为例)
1.传代条件：
① 细胞汇合度达85%左右，一般情况下每3-4天传代;
② 细胞汇合度较低，生长密度分布不均匀。
注：即使克隆团较小、汇合度不足，也建议不要连续培养超过5天。
2. 传代比例：可根据细胞生长状态和实验需要按1:5~1:12的比例进行传代，如果细胞正常，克隆团汇合度85%，大小均匀，建议按照1:8进行传代，如果密度偏低，则可降低传代比例;密度偏高，则增加传代比例。
注：1:8传代就是1个孔瓶传8个孔(以6孔板为例)。
3. 将 matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温(~25℃)。
4. 根据传代接种的孔数准备2 ml/孔的hesc/ipsc complete medium，并按1：4000比例加入hesc/ipsc supplement c，恢复至室温(~25℃)。
5. 将 matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温(~25℃)。
6. 根据传代接种的孔数准备2 ml/孔的hesc/ipsc complete medium，并按1：4000比例加入hesc/ipsc supplement c，恢复至室温(~25℃)。
7. 将孔内培养基吸取，加入2 ml/孔的dpbs(不含钙镁)，轻轻摇晃并吸取。
8. 加入2 ml/孔的 hesc/ipsc passage solution使溶液覆盖孔底。
9. 置于37℃培养箱中孵育8-9 min。
注：① 消化8-9 min后镜下观察细胞变化，当大部分细胞变亮变圆，且细胞尚未脱离基质或漂起时即可终止消化，若大部分细胞仍未变亮，则需要延长消化时间;
② 保持6孔板与培养箱金属隔板直接接触，使6孔板受热均匀，不要叠放。
10. 消化结束后轻轻地将细胞培养板拿回生物安全柜，避免震荡摇晃细胞，倾斜并吸除hesc/ipsc passage solution。
11. 及时加入2 ml/孔预温的hesc/ipsc complete medium+ hesc/ipsc supplement c，水平十字摇晃6孔板使细胞脱离基质。
注：① 加hesc/ipsc complete medium + hesc/ipsc supplement c时，可轻柔吹打细胞1-2次，不能超过2次，避免反复吹打;有部分细胞(10%～15%)未脱离基质是正常现象，若有大量细胞未脱离则需延长消化时间(< 10min)。 ② hesc细胞不能长时间处于hesc/ipsc passage solution(<15 min)，所以收集接种细胞时操作必须快速,以及一次操作不要超过4孔(六孔板)。
12. 吸取6孔板中的matrigel溶液，加入预温的hesc/ipsc complete medium+ hesc/ipsc supplement c 2 ml/孔。
13. 在6孔板上标记细胞名称、代次、传代比例、日期、操作人。将步骤9获得的细胞悬液轻轻摇匀，按预先设定的传代比例均匀分配于孔板中。
注：为了铺板均匀并降低对细胞的损伤，可以将步骤9获得的细胞悬液收集至2ml离心管，轻柔颠倒混匀细胞1-2次;再按照传代比例接种。
14. 接种后，水平十字摇匀6孔板三次，置于37℃，5% co2浓度，饱和湿度的培养箱中， 再次水平十字摇匀6孔板三次，培养过夜。
15. 18-24小时后更换新hesc/ipsc complete medium，此后每天换液，4-5天后继续传代/冻存。
3)h9人胚胎干细胞冻存方法(以6孔板为例)
1. 当细胞汇合度达85%左右可收获冻存，一般6孔板每孔可冻存1管。
2. 准备相应数量的1.5/2 ml冻存管，标记细胞名称、代次(p#)、日期、操作人。
3. 取出4℃冰箱中的 hesc/ipsc cryopreservation solution，置于室温预温，使用前注意摇匀。
4. 吸取上清液，加入2 ml/孔的dpbs(不含钙镁)，轻轻摇晃数次，再吸取。
5. 加入2 ml/孔的hesc/ipsc passage solution，将细胞置于37℃培养箱中，计时8-9 min。
6. 消化结束，轻轻取出培养板，吸取hesc/ipsc passage solution。
7. 摇匀预温的hesc/ipsc cryopreservation solution，每孔加入1 ml冻存液，轻柔吹打，水平十字摇匀3次，随后吸取细胞悬液加入1.5/2 ml冻存管中。
8. 将细胞置于梯度程序降温盒中，并置-80℃冰箱中过夜，次日转入液氮罐中长期保存。
h9人胚胎干细胞培养注意事项 1.复苏h9人胚胎干细胞时，细胞悬液离心后，要避免弄散细胞团，否则将降低细胞贴壁率和成活率；
2.培养h9人胚胎干细胞过程中，需要每天换液；
3.如在培养过程中观察到明显的分化细胞集落，及时刮除；
4.当细胞集落变得较大、中心变得密集和明亮(对比其边缘)而相邻的集落即将融合时，必须进行传代。细胞集落融合后很容易自发分化；
5.如果传代前观察到细胞分化较多，可在镜下寻找未分化集落并在培养器皿底部标记好，消化后(该过程一定不要超过1min)用细胞刮刀刮下该区域细胞进行传代培养；
6.h9人胚胎干细胞冻存时同样要求注意保持细胞团完整。
h9人胚胎干细胞应用胚胎干细胞(embryonic stem cell，escs，简称es、ek或esc细胞)是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，es细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型—这象征着它具有非好的医疗应用前景，尤其是移植医学。
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1)h9人胚胎干细胞复苏方法(以6孔板为例)
1. 将水浴锅预热至37℃，并将matrigel包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温(15~30℃)。
2. 取4 ml hesc/ipsc complete medium，按照1:4000比例加入1 μl的hesc/ipsc supplement c，恢复至室温(15~30℃)。
注意：不要在37℃水浴锅中预温培养基。
3. 取出1支冷冻的细胞置于37℃水浴锅手持轻轻摇晃，2 min内解冻，肉眼观察细胞悬液内冰晶即将消失时取出。
4. 75%酒精无尘纸擦拭冻存管表面，转入生物安全柜；将细胞悬液移到事先准备好的15 ml 离心管中，随后缓慢逐滴加入10ml dmem/f12，过程中轻柔晃动混匀细胞，160g离心5 min。
5. 吸弃上清，加入预温的4 ml的hesc/ipsc complete medium+hesc/ipsc supplement c制备细胞悬液，尽量避免吹打。
注：可留20 μl上清液，轻弹管底，使细胞悬浮液更均匀，避免成较大细胞团。
6. 吸除6孔板中2孔的matrigel包被液，将细胞悬液按照2 ml/孔接种到1个孔中。
7. 水平十字摇匀三次，置于37℃，5% co2浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀三次培养。
8. 18-24小时后换新的hesc/ipsc complete medium，之后每天更换培养基。
注：在hesc培养过程中，如果细胞的汇合度超过50%，建议更换培养基时，培养基的体积增加至3-4ml/孔。
2)h9人胚胎干细胞传代方法(以6孔板为例)
1.传代条件：
① 细胞汇合度达85%左右，一般情况下每3-4天传代;
② 细胞汇合度较低，生长密度分布不均匀。
注：即使克隆团较小、汇合度不足，也建议不要连续培养超过5天。
2. 传代比例：可根据细胞生长状态和实验需要按1:5~1:12的比例进行传代，如果细胞正常，克隆团汇合度85%，大小均匀，建议按照1:8进行传代，如果密度偏低，则可降低传代比例;密度偏高，则增加传代比例。
注：1:8传代就是1个孔瓶传8个孔(以6孔板为例)。
3. 将 matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温(~25℃)。
4. 根据传代接种的孔数准备2 ml/孔的hesc/ipsc complete medium，并按1：4000比例加入hesc/ipsc supplement c，恢复至室温(~25℃)。
5. 将 matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温(~25℃)。
6. 根据传代接种的孔数准备2 ml/孔的hesc/ipsc complete medium，并按1：4000比例加入hesc/ipsc supplement c，恢复至室温(~25℃)。
7. 将孔内培养基吸取，加入2 ml/孔的dpbs(不含钙镁)，轻轻摇晃并吸取。
8. 加入2 ml/孔的 hesc/ipsc passage solution使溶液覆盖孔底。
9. 置于37℃培养箱中孵育8-9 min。
注：① 消化8-9 min后镜下观察细胞变化，当大部分细胞变亮变圆，且细胞尚未脱离基质或漂起时即可终止消化，若大部分细胞仍未变亮，则需要延长消化时间;
② 保持6孔板与培养箱金属隔板直接接触，使6孔板受热均匀，不要叠放。
10. 消化结束后轻轻地将细胞培养板拿回生物安全柜，避免震荡摇晃细胞，倾斜并吸除hesc/ipsc passage solution。
11. 及时加入2 ml/孔预温的hesc/ipsc complete medium+ hesc/ipsc supplement c，水平十字摇晃6孔板使细胞脱离基质。
注：① 加hesc/ipsc complete medium + hesc/ipsc supplement c时，可轻柔吹打细胞1-2次，不能超过2次，避免反复吹打;有部分细胞(10%～15%)未脱离基质是正常现象，若有大量细胞未脱离则需延长消化时间(< 10min)。 ② hesc细胞不能长时间处于hesc/ipsc passage solution(<15 min)，所以收集接种细胞时操作必须快速,以及一次操作不要超过4孔(六孔板)。
12. 吸取6孔板中的matrigel溶液，加入预温的hesc/ipsc complete medium+ hesc/ipsc supplement c 2 ml/孔。
13. 在6孔板上标记细胞名称、代次、传代比例、日期、操作人。将步骤9获得的细胞悬液轻轻摇匀，按预先设定的传代比例均匀分配于孔板中。
注：为了铺板均匀并降低对细胞的损伤，可以将步骤9获得的细胞悬液收集至2ml离心管，轻柔颠倒混匀细胞1-2次;再按照传代比例接种。
14. 接种后，水平十字摇匀6孔板三次，置于37℃，5% co2浓度，饱和湿度的培养箱中， 再次水平十字摇匀6孔板三次，培养过夜。
15. 18-24小时后更换新hesc/ipsc complete medium，此后每天换液，4-5天后继续传代/冻存。
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1. 当细胞汇合度达85%左右可收获冻存，一般6孔板每孔可冻存1管。
2. 准备相应数量的1.5/2 ml冻存管，标记细胞名称、代次(p#)、日期、操作人。
3. 取出4℃冰箱中的 hesc/ipsc cryopreservation solution，置于室温预温，使用前注意摇匀。
4. 吸取上清液，加入2 ml/孔的dpbs(不含钙镁)，轻轻摇晃数次，再吸取。
5. 加入2 ml/孔的hesc/ipsc passage solution，将细胞置于37℃培养箱中，计时8-9 min。
6. 消化结束，轻轻取出培养板，吸取hesc/ipsc passage solution。
7. 摇匀预温的hesc/ipsc cryopreservation solution，每孔加入1 ml冻存液，轻柔吹打，水平十字摇匀3次，随后吸取细胞悬液加入1.5/2 ml冻存管中。
8. 将细胞置于梯度程序降温盒中，并置-80℃冰箱中过夜，次日转入液氮罐中长期保存。
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2.培养h9人胚胎干细胞过程中，需要每天换液；
3.如在培养过程中观察到明显的分化细胞集落，及时刮除；
4.当细胞集落变得较大、中心变得密集和明亮(对比其边缘)而相邻的集落即将融合时，必须进行传代。细胞集落融合后很容易自发分化；
5.如果传代前观察到细胞分化较多，可在镜下寻找未分化集落并在培养器皿底部标记好，消化后(该过程一定不要超过1min)用细胞刮刀刮下该区域细胞进行传代培养；
6.h9人胚胎干细胞冻存时同样要求注意保持细胞团完整。
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