α-甘露糖苷酶（α-Mannosidase,α-Man）活性测定试剂盒说明书
本试剂盒仅供科研使用
α-甘露糖苷酶（α-mannosidase,α-man）活性测定试剂盒说明书
（货号：ws0270f 分光法 24 样）
一、产品简介 ： α-甘露糖苷酶（ec 3.2.1.24,α-man）是参与植物体内 n-聚糖加工的关键酶之一。是植物 细胞壁糖蛋白代谢过程中的关键性糖苷酶，在分生组织的生长、果实的成熟软化、种子的 萌发等生理进程中起重要作用。 α-甘露糖苷酶（α-man）催化对硝基*酚-α-d-吡喃甘露糖苷产生对硝基*酚（pnp）， 该产物在 405nm 处有特征吸收峰，通过测定 405nm 光吸收增加速率，即可计算α-甘露糖 苷酶活性。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 30ml×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 支 4℃保存 用前甩几下使试剂落入底部，再 加 1.1ml 蒸馏水超声溶解备用。 试剂二 液体 20ml×1 瓶 4℃保存 试剂三 液体 20ml×1 瓶 4℃保存 标准品 粉剂×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品： 可见分光光度计、1ml 玻璃比色皿（光径 1cm）、可调式移液器、低温离心机、天平、 研钵、冰和蒸馏水。 四、α-甘露糖苷酶（α-man）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本的制备： ① 组织样本：取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g），加入 1ml 提取液，进行冰 浴匀浆。12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(ml)为 1：5~10 比例提取。 ② 细菌或细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细 胞，加入 1ml 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200w，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】若增加样本量，可按照细菌或细胞数量(104个)：提取液体积(ml)为 500~1000：1 的比例提取。 ③ 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 可见分光光度计预热 30min，调节波长至 405nm，蒸馏水调零。 ② 所有试剂解冻至室温（25℃）在 ep 管中依次加入： 试剂名称（μl） 测定管 对照管 样本 30 30 试剂一 40 试剂二 300 340 迅速混匀，37℃保温 30min 试剂三 350 350本试剂盒仅供科研使用 2 混匀，5min 后吸取全部澄清液体至 1ml 玻璃比色 皿（光径 1cm）中，立即于 405nm 下读取吸光值 a， δa=a 测定-a 对照（每个测定管需设一个对照管）。 【注】：1. 若δa 在零附近，可增加样本加样体积 v1（即加样量增加至 60μl，则试剂二相应减 少），或延长保温时间 t（如：由 30min 延长至 60min 或更长），重新调整的 v1 和 t 需代入计算公式重新计算。 2. 若 a 测定值大于 1.5，可对样本上清液用蒸馏水稀释，则稀释倍数 d 代入公式计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y = 0.0158x - 0.0018；x 为标准品摩尔质量（nmol），y 为δa。 2、按蛋白浓度计算： 酶活定义：每毫克蛋白每分钟催化产生 1 nmol 对硝基*酚(pnp)为一个酶活单位。 α-甘露糖苷酶活性(nmol/min/mg prot)=(δa+0.0018)÷0.0158÷(v1×cpr)÷t×d =70.3×(δa+0.0018)÷ cpr×d 3、按样本质量计算： 酶活定义：每克组织每分钟催化产生 1 nmol 对硝基*酚(pnp)为一个酶活单位。 α-甘露糖苷酶活性(nmol/min/g 鲜重)=(δa+0.0018)÷0.0158÷(v1÷v×w)÷t×d =70.3×(δa+0.0018)÷w×d 4、按细胞数量计算： 酶活定义：每 104个细胞每分钟催化产生 1 nmol 对硝基*酚(pnp)为一酶活单位。 α-甘露糖苷酶活性(nmol/min/104cell)=(δa+0.0018)÷0.0158÷(v1÷v×细胞数量)÷t×d =70.3×(δa+0.0018)÷细胞数量×d 5、按液体体积计算： 酶活定义：每毫升液体每分钟催化产生 1 nmol 对硝基*酚(pnp)为一个酶活单位。 α-甘露糖苷酶活性(nmol/min/ml)=(δa+0.0018)÷0.0158÷v1÷t×d=70.3×(δa+0.0018)×d v---加入提取液体积，1ml； v1---加入反应体系中样本体积，30μl=0.03ml； w---样本质量，g； 500---细胞或细菌总数，500 万； t---反应时间，30min； d---稀释倍数，未稀释即为 1； cpr---样本蛋白质浓度，mg/ml，建议使用本公司的 bca 蛋白含量检测试剂盒； 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（10μmol/ml）：向标准品 ep 管里面加入 1ml 蒸馏水。 2 把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2μmol/ml。也可根据实际 样本来调整标准品浓度。 3 在 ep 管中依次加入：30μl 标准品+340μl 试剂二+350μl 试剂三，混匀转移全部液 体至 1ml 玻璃比色皿（光径 1cm）中，于 405nm 下读取吸光值，根据结果制作标 准曲线。
关键词：分光光度计 移液器 离心机 浓度计
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一、产品简介 ： α-甘露糖苷酶（ec 3.2.1.24,α-man）是参与植物体内 n-聚糖加工的关键酶之一。是植物 细胞壁糖蛋白代谢过程中的关键性糖苷酶，在分生组织的生长、果实的成熟软化、种子的 萌发等生理进程中起重要作用。 α-甘露糖苷酶（α-man）催化对硝基*酚-α-d-吡喃甘露糖苷产生对硝基*酚（pnp）， 该产物在 405nm 处有特征吸收峰，通过测定 405nm 光吸收增加速率，即可计算α-甘露糖 苷酶活性。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体 30ml×1 瓶 4℃保存 试剂一 粉剂 mg×1 支 4℃保存 用前甩几下使试剂落入底部，再 加 1.1ml 蒸馏水超声溶解备用。 试剂二 液体 20ml×1 瓶 4℃保存 试剂三 液体 20ml×1 瓶 4℃保存 标准品 粉剂×1 支 4℃保存 若重新做标曲，则用到该试剂。 三、所需的仪器和用品： 可见分光光度计、1ml 玻璃比色皿（光径 1cm）、可调式移液器、低温离心机、天平、 研钵、冰和蒸馏水。 四、α-甘露糖苷酶（α-man）活性测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1、样本的制备： ① 组织样本：取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g），加入 1ml 提取液，进行冰 浴匀浆。12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(ml)为 1：5~10 比例提取。 ② 细菌或细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细 胞，加入 1ml 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200w，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】若增加样本量，可按照细菌或细胞数量(104个)：提取液体积(ml)为 500~1000：1 的比例提取。 ③ 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。 2、上机检测： ① 可见分光光度计预热 30min，调节波长至 405nm，蒸馏水调零。 ② 所有试剂解冻至室温（25℃）在 ep 管中依次加入： 试剂名称（μl） 测定管 对照管 样本 30 30 试剂一 40 试剂二 300 340 迅速混匀，37℃保温 30min 试剂三 350 350本试剂盒仅供科研使用 2 混匀，5min 后吸取全部澄清液体至 1ml 玻璃比色 皿（光径 1cm）中，立即于 405nm 下读取吸光值 a， δa=a 测定-a 对照（每个测定管需设一个对照管）。 【注】：1. 若δa 在零附近，可增加样本加样体积 v1（即加样量增加至 60μl，则试剂二相应减 少），或延长保温时间 t（如：由 30min 延长至 60min 或更长），重新调整的 v1 和 t 需代入计算公式重新计算。 2. 若 a 测定值大于 1.5，可对样本上清液用蒸馏水稀释，则稀释倍数 d 代入公式计算。 五、结果计算： 1、标准曲线方程：y = 0.0158x - 0.0018；x 为标准品摩尔质量（nmol），y 为δa。 2、按蛋白浓度计算： 酶活定义：每毫克蛋白每分钟催化产生 1 nmol 对硝基*酚(pnp)为一个酶活单位。 α-甘露糖苷酶活性(nmol/min/mg prot)=(δa+0.0018)÷0.0158÷(v1×cpr)÷t×d =70.3×(δa+0.0018)÷ cpr×d 3、按样本质量计算： 酶活定义：每克组织每分钟催化产生 1 nmol 对硝基*酚(pnp)为一个酶活单位。 α-甘露糖苷酶活性(nmol/min/g 鲜重)=(δa+0.0018)÷0.0158÷(v1÷v×w)÷t×d =70.3×(δa+0.0018)÷w×d 4、按细胞数量计算： 酶活定义：每 104个细胞每分钟催化产生 1 nmol 对硝基*酚(pnp)为一酶活单位。 α-甘露糖苷酶活性(nmol/min/104cell)=(δa+0.0018)÷0.0158÷(v1÷v×细胞数量)÷t×d =70.3×(δa+0.0018)÷细胞数量×d 5、按液体体积计算： 酶活定义：每毫升液体每分钟催化产生 1 nmol 对硝基*酚(pnp)为一个酶活单位。 α-甘露糖苷酶活性(nmol/min/ml)=(δa+0.0018)÷0.0158÷v1÷t×d=70.3×(δa+0.0018)×d v---加入提取液体积，1ml； v1---加入反应体系中样本体积，30μl=0.03ml； w---样本质量，g； 500---细胞或细菌总数，500 万； t---反应时间，30min； d---稀释倍数，未稀释即为 1； cpr---样本蛋白质浓度，mg/ml，建议使用本公司的 bca 蛋白含量检测试剂盒； 附：标准曲线制作过程： 1 制备标准品母液（10μmol/ml）：向标准品 ep 管里面加入 1ml 蒸馏水。 2 把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2μmol/ml。也可根据实际 样本来调整标准品浓度。 3 在 ep 管中依次加入：30μl 标准品+340μl 试剂二+350μl 试剂三，混匀转移全部液 体至 1ml 玻璃比色皿（光径 1cm）中，于 405nm 下读取吸光值，根据结果制作标 准曲线。
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