PCR 引物设计

好的引物会让pcr实验成功一半，因而，引物设计一直都是pcr非常重要的环节。经典之法就是让premier5携手oligo，共同设计pcr引物。1、以小鼠的il-17为例，进入ncbi界面,选择nucleotide后，输入il-17，点击search。然后选择人类il-17的mrna，在cds选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，选定目的序列。2、打开primerpremier5软件，点击菜单栏file|new|dnasequence，在出现的对话框里黏贴目的序列，并在paste对话框里选择asis，点击ok。3、点击primer，弹出菜单后点击search按钮。在弹出的searchcriteria中，选择pcrprimers，pairs参数，并选择所需pcr产物长度，点击ok。在弹出的search progress菜单中，点击ok。4、在搜索出的结果列表里选择rating值高，bug较少的引物#1，在primerpremier中选择s（正义链）/a（反义链），点击editprimer，将所得引物改成为rating值为100，无bug的引物，即无发夹（hairpin）、无二聚体（dimer）、无错配（falsepriming）和交叉配对（crossdimer）的引物。点击acceptandquit命令即可。5、点击菜单栏中edit∣copy∣senseprimer/anti-senseprimer，即可得到设计的引物。6、接下来，就要用oligo软件验证评估premier5软件所设计的引物，单击菜单栏里file∣newsequence可打开以下窗口，并将设计好的上游引物黏贴在空白框里。7、点击菜单栏里accept/discard中的accept，则会出现tm、△g和frq三个窗口,△g值反应了序列与模板的结合强度，最好引物的△g值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对较低。8、点击菜单栏里的select中的upperprimer将当前引物设置为上游引物。同时点击菜单栏里的edit中的“lowerprimer”命令，在editlower窗口中输入下游引物的序列。点击acceptandquit命令即可。9、最后，在菜单栏中analyze完成引物△g值、tm值、引物二聚体和发夹结构的分析后，可将引物序列送至公司进行合成即可。
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