电动移液器对PCR准确度的影响
摘要
定量聚合酶链反应（qpcr）分析具有高灵敏度，这是其成功并广泛应用于科学实验室的最重要原因之一。然而，包括移液技术在内的许多因素都会对qpcr分析的结果产生影响。pcr master mix 通常在qpcr准备期间使用，但可能很难对其进行准确移液。在本研究中，我们测试了在qpcr中使用电动移液器移取master mix。研究证明，使用电动移液器搭配低吸附滤芯吸头或标准滤芯吸头对master mix移液，可获得良好的精准性，并能确保移液速度及结果的重现性。从而得出结论，在进行基于pcr的分析时，使用电动移液器移取master mix确保得到可重复且可靠的结果。
引言
基于pcr的应用已成为生物制药工艺、临床诊断和学术研究的关键手段。然而，在执行定量聚合酶链反应（qpcr）时，实验结果的可变性可能是个问题，移液误差是需要重点关注的变化来源之一。在qpcr准备阶段，对master mix试剂进行移液具有挑战性。master mix通常由聚合酶、dntp、mgcl2以及可能含吐温和甘油成分的缓冲液组成。
本应用说明的目的是测试在pcr分析应用中使用电动移液器移取master mix的可靠性。在定量pcr准备阶段，使用电动移液器搭配低吸附滤芯吸头来移取master mix，实验结果（定量循环，cq）由准确度和精准度（重现性）来进行评价。
方法
移液器和移液器吸头选择
使用picus®电动移液器、safetyspace低吸附滤芯吸头和滤芯吸头。picus®使用多次分液模式。移取master mix时，将电动移液器速度参数设置为1。
qpcr准备
qpcr准备阶段使用picus®电动移液器、safetyspace滤芯吸头及低吸附滤芯吸头。lo-bind ep管用于dna样品制备及master mix的制备。制备用于所有测试的pcr master mix储备液使用了maximasybr green qpcr master mix（不含rox）、大肠杆菌uida基因引物以及无核酸酶水。
用移液器将八个 15μl 的master mix重复样品移取至pcr板孔中，用于各种测试条件。无模板对照（ntc）样品不含大肠杆菌基因组dna，并加入 5μl 无核酸酶水。用类似方法移取 5μl 含有1×106、1×105、1×104、1×103 以及1×102 个拷贝丨反应大肠杆菌gdna的系列稀释标准品。
在每个测试孔中有 5μl 含有1×103 个拷贝丨反应的大肠杆菌gdna。使用picus® 电动移液器的多次分液功能及低吸附滤芯吸头以相同的方式将所有dna样本添加到pcr管中。使用lightcycler®480 qpcr仪进行qpcr。循环参数如下：在 95°c下预培养 10 分钟，随后在 95°c 10 秒、55°c 10 秒、75°c 15 秒，75°c延伸 10 秒，40 次循环。
对标准品、对照品和样品中的sybr绿色荧光激发进行定量。使用lightcycler® 480软件确定定量循环（cq）值和实际拷贝数，并使用ms excel分析结果。
数据分析
cq值的百分比系统误差（%s）反映了处理master mix的仪器系统（移液器和吸头系统）cq值的误差。移液过程中的随机误差是结果精准度的测量，反映了实验中重复样品之间的差异。cq值的百分比随机误差（%r）反映了结果的重现性，并且可能受到实验人员移液操作的影响。
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引言
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方法
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数据分析
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