蛋白质印迹 (WB) – 实验方案
蛋白质印迹是一种常用的分子生物学技术，用于分析样品中感兴趣的蛋白质。细胞裂解物由细胞培养物裂解产生，并在凝胶电泳 (sds-page) 中按重量分离。然后这些蛋白质从凝胶转移到膜上，在膜上它们被封闭并用特异性抗体探测以检测感兴趣的蛋白质。借助灵敏且特异的抗体，可以轻松检测小样品中的修饰蛋白质或未修饰蛋白质。
协议：
1. 在封闭液（tbst 中的 5% 脱脂牛奶（50mm tris、100mm nacl、0.05% tween-20，ph 7.6）中振荡孵育 1 小时，封闭膜。
注意：对于磷酸化特异性抗体，使用封闭液中的 5% bsa。
2. 在封闭液中以适当的稀释度稀释一抗。
3. 将膜与稀释的一抗在 40°c 下搅拌孵育过夜。
4. 去除抗体溶液。室温下在 tbst（50mm tris、100mm nacl、0.05% tween-20、ph 7.6）中摇动洗涤膜 3 次，每次 5-10 分钟。
注意：将 tween-20 浓度增加至 0.1% 可降低背景并提高特异性，但会降低灵敏度。
5. 将膜与在封闭液中稀释（根据制造商说明）的二级 ap 或 hrp 缀合物一起在室温下振荡孵育 1 小时。
6. 按照步骤 4 清洗膜。
7. 在进行化学发光反应之前，用 tbs 清洗膜 2-5 分钟。
8. 根据制造商的说明制备和使用化学发光底物（用于 ap 或 hrp）。
9. 立即包裹膜并在 x 射线胶片下曝光 10 秒至 1 小时。暴露时间可能根据抗体和抗原的量而变化。或者放入成像仪中并进行相应调整。
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2. 在封闭液中以适当的稀释度稀释一抗。
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4. 去除抗体溶液。室温下在 tbst（50mm tris、100mm nacl、0.05% tween-20、ph 7.6）中摇动洗涤膜 3 次，每次 5-10 分钟。
注意：将 tween-20 浓度增加至 0.1% 可降低背景并提高特异性，但会降低灵敏度。
5. 将膜与在封闭液中稀释（根据制造商说明）的二级 ap 或 hrp 缀合物一起在室温下振荡孵育 1 小时。
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