人肝脏类器官培养手册
人肝脏类器官培养手册
背景介绍肝脏是人体中最大的器官之一，来源于内胚层中前肠上皮细胞发育而来的肝芽结构，以代谢功能为主，发挥“解毒”作用。肝功能失衡会导致称为肝衰竭的病理状况，并导致肝炎、纤维化、肝硬化、癌症、代谢或自身免疫性疾病。因此，为充分了解每种肝病的表型和损伤器官的机制，我们需要体外个性化肝模型系统进行疾病建模、药物发现和药物毒性学习。
肝脏类器官(hepatic organoids, hlo, ho)是肝脏功能的3d模型，保留了肝细胞的主要生理特征。在存在或不存在基质的情况下，可以从ipsc、esc或特定的成体细胞（例如上皮细胞或上皮细胞和间充质细胞）生成类器官。
肝脏类器官的培养方案我们根据jci insight[1]、cell metab[2]和j hepatol[3]发表的三篇文章，整理了由人类诱导多能干细胞(human ipscs)生成肝脏类器官的培养方案。
图1.ipsc分化为肝类器官的过程(pmid: 28878125)[1]
a：ipsc分化为肝类器官的示意图；b-c：在第0天(ipscs)、第3天（定形内胚层，en）、第6天（前肠，fg）、第9天（成肝细胞，hb)、第20天(ho1)和第62天(ho2)在ho发育过程中发生的形态学和细胞标记变化。
诱导定型内胚层ipsc在含有5 mm edta和10 mm y-27632的缓冲液解离为单个细胞，接种到低吸附的6孔板上，然后用含有激活素a (100 ng/ml)和bmp4 (10 ng/ml)的rpmi-1640培养基培养3天；
诱导前肠球体更换为含有2% matrigel和b27的rpmi培养基；第3 -6天，培养基中加入50 ng/mlfgf10；第6-9天，培养基中加入10 ng/mlfgf10和10 ng/mlbmp4；
诱导类器官第9天后，更换为含有1% matrigel、50 ng/mlhgf、50 ng/mloncostatin m和10 μm dexamethasone的类器官生长和分化培养基(hcm)中。
图2.ipsc分化为肝类器官的过程(pmid: 31155493)[2]
a：ipsc分化为肝类器官的示意图；b：在第0天(ipscs)和第20天(hlo)明场图像。
类器官扩增在第20天收集培养物，将细胞解离，200 g离心3 min收集细胞，重悬于50 μl gfr-matrigel中，接种到24孔板中。matrigel凝固后，加入1ml生长培养基(rpmi-1640, b27, 250 nm ldn-193189, 3 μm chir99021, 10 μm a83-01, 100 ng/mlegf, 10 ng/mlfgf10和20 ng/mlhgf)，培养细胞6天，更换为分化培养基(hcm medium, 10 μm dapt, 10 ng/mloncostatin m, 20 ng/mlhgf, 10 μm dexamethasone, 10 ng/mlbmp4)再培养6天。
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产品名称
产品编号
规格
简介
y-27632
53006es
1mg/5 mg/10 mg
rock抑制剂
chir99021
53003es
2mg/5 mg/10 mg
gsk-3α/β抑制剂
dexamethasone地塞米松
53269es
250 mg/500 mg/1 g
糖皮质激素受体激动剂
ldn193189
53012es
5 mg/10 mg
bmp信号通路抑制剂
a 83-01
53002es
1mg/5 mg/10 mg
tgf-β信号抑制剂
dapt
52104es
10 mg/50 mg
notch通路抑制剂
human bmp4
92053es
10μg/100μg/500μg
重组蛋白
human egf
92708es
100μg/500μg
重组蛋白
human activin a
91702es
10μg/100μg/500μg
重组蛋白
human fgf4
91303es
5μg/100μg/500μg
重组蛋白
human fgf10
91306es
5μg/100μg/500μg
重组蛋白
human hgf
92055es
10μg/50μg/1mg
重组蛋白
human oncostatin m
92254es
10μg/100μg/500μg
重组蛋白
n-2 supplement,serum free,100x
60706es
5 ml
用于细胞和组织体外培养
hepes溶液(1 m)，细胞培养级
60117es
100 ml
化学缓冲剂
sodium pyruvate丙酮酸钠
60370es
10 g/100 g
抗氧化
bsa牛血清白蛋白,诊断级别
36102es
25 g/100 g/500 g/1 kg
用于细胞培养
50× b-27无血清添加剂，去除维生素a
60704es
10 ml
无血清添加剂
参考文献[1]guan y, et al. human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. jci insight
. 2017 sep 7;2(17):e94954.
[2]ouchi r, et al. modeling steatohepatitis in humans with pluripotent stem cell-derived organoids. cell metab. 2019 aug 6;30(2):374-384.e6.
[3]mun sj, et al. generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids. j hepatol. 2019 nov;71(5):970-985.
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诱导前肠球体更换为含有2% matrigel和b27的rpmi培养基；第3 -6天，培养基中加入50 ng/mlfgf10；第6-9天，培养基中加入10 ng/mlfgf10和10 ng/mlbmp4；
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human bmp4
92053es
10μg/100μg/500μg
重组蛋白
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92708es
100μg/500μg
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91702es
10μg/100μg/500μg
重组蛋白
human fgf4
91303es
5μg/100μg/500μg
重组蛋白
human fgf10
91306es
5μg/100μg/500μg
重组蛋白
human hgf
92055es
10μg/50μg/1mg
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92254es
10μg/100μg/500μg
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