引物设计原则

1)扩增产物长度100bp-150bp为佳;2)引物长度17bp-25bp最好;3)正向引物和反向引物的tm值最好相差不要超过1℃。tm值调整至60℃-65℃为佳;4)引物的gc含量控制在40%-60%之间,最佳为45%-55%;5)引物3'末端碱基最好为g或c或a,避免使用t;6)避开引物内部或者两条引物之间有3个碱基以上的互补序列,二条引物之间的3'端避开有2个碱基以上的互补序列;7)引物a、g、c、t整体分布尽量要均匀,避免使用gc或者ta含量高的区域,尤其是3'端,必须避开gc 含量不均匀的区域;8)最好跨内含子设计引物。
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