PCR扩增产物的检测分析
pcr扩增反应完成之后，必须通过严格的鉴定，才能确定是否真正得到了准确可靠的预期特定扩增产物。凝胶电泳是检测pcr产物常用和zui简便的方法，能判断产物的大小，有助于产物的鉴定。凝胶电泳常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者主要用于dna pian段大于100bp者，后者主要用来检测小片段dna。
1．琼脂糖凝胶电泳
这是实验室zui常用的方法，简便易行，只需少量dna即可进行实验。其原理是不同大小的dna分子通过琼脂糖凝胶时，由于泳动速度不同而被分离，经溴化乙锭（eb）染色，在紫外光照射下dna分子发出荧光而判定其分子的大小。
用于电泳检测pcr产物的琼脂糖浓度常为1%—2%，应该使用纯度高的电泳纯级琼脂糖，这种琼脂糖已除去了荧光抑制剂及核酸酶等杂质。
（1）制胶
琼脂糖凝胶厚度约为3~5mm。过薄则加样孔样品会溢出来，过厚观察时荧光穿透不强以至有些小片段dna带型不易分辨。如配制2%凝胶100ml，称取琼脂糖2g于三角瓶中，加入100ml0.5×tbe液，微波炉加热2-5min，使琼脂糖*溶解（注意不要暴沸），置室温等温度下降至60℃时，加入终浓度0.5μg/ml的eb液，充分混匀后倒板（注意排除气体）。
（2）加样和电泳
上样时一般取pcr反应液5~10μl，加入3μl溴酚兰液，充分混匀，加入凝胶加样孔中。电泳仪可用一般稳压可调中压电泳仪，电泳工作液为0.5×tbe液，接通电源，使样品由负极向正极移动。60-100v恒压电泳约30-60分钟。
（3）检测
将凝胶板放在紫外透射仪的石英玻璃台上进行检测，dna产物与荧光染料eb形成橙黄色荧光复合物。观察各泳道是否有橙黄色荧光带出现，并与扩增时所设的阳性对照比较，判断阳性或阴性结果。也可在电泳时以标准分子量作对照，判断其扩增片段是否与设计的大小相一致。
2、聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳繁琐，但在引物纯化、pcr扩增指纹图、多重pcr扩增、pcr扩增产物的酶切限制性长度多态性分析时常用到。
它与琼脂糖凝胶电泳比较具有如下优点：
①分辨率很强，可达1bp；
②能装载的dna量大，达每孔10μgdna；
③回收的dna纯度高；
④其银染法的灵敏度较琼脂糖中eb染色法高2~5倍；
⑤避免了eb迅速退色的弱点，银染的凝胶干燥后可*保存。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨dna pian段的有效范围：
(1)制胶
在两块制胶玻璃板中间放上垫片，放上制胶架，拧紧制胶螺丝夹紧玻璃板。
制备适量合适浓度的凝胶，使之略多于胶板。制备100μl体积凝胶的配制方法见下表。
不同浓度（%）聚丙酰胺凝胶的制法：
试剂
3.5%
5%
8%
12%
20%
30%丙烯酰胺溶液（ml）
11.6
16.6
26.6
40
66.6
水（ml）
67.7
62.7
26.6
40
66.6
5×tbe（ml）
20
20
20
20
20
10%过硫酸铵（ml）
0.7
0.7
0.7
0.7
0.7
temed（ml）
0.035
0.035
0.035
0.035
0.035
在加入temed和10%过硫酸铵后，立即混匀，倒入放置45℃角的玻璃板内，*注满（注意不要有气泡），迅速将玻璃板放置水平位置。立即放成型梳子于腔顶并夹紧，待30-60分钟胶聚合后，取下胶板，放入电泳槽中固定。
（2）加样和电泳
上下槽中加入1×tbe电泳缓冲液，溢过加样孔，拔出梳子，排出加样孔中的气泡，将pcr产物或限制性内切酶消化产物2与1上样缓冲液混匀，用微量注射器加入加样孔底部，使样品在孔底成一层，两侧孔中加入标准分子量的dnamarker。
以2-10v/cm电压电泳，电泳时间足够长，使片断足以分开，待指示剂走到适宜位置时关闭电源，将胶片取出。
（3）银染
分开两块玻璃板，将凝胶片放入100ml银染固定液中振荡15min，双蒸水洗3次，每次2min，然后将凝胶片转入100ml0.2%的agno3中于摇床上染色约10min，吸去agno3液，用双蒸水洗3次，每次30s，加入100ml显色液约7-10min，待dna带显示清除时，吸去显色液，加入固定液na2co3，静置2-3min，取出凝胶观察。
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这是实验室zui常用的方法，简便易行，只需少量dna即可进行实验。其原理是不同大小的dna分子通过琼脂糖凝胶时，由于泳动速度不同而被分离，经溴化乙锭（eb）染色，在紫外光照射下dna分子发出荧光而判定其分子的大小。
用于电泳检测pcr产物的琼脂糖浓度常为1%—2%，应该使用纯度高的电泳纯级琼脂糖，这种琼脂糖已除去了荧光抑制剂及核酸酶等杂质。
（1）制胶
琼脂糖凝胶厚度约为3~5mm。过薄则加样孔样品会溢出来，过厚观察时荧光穿透不强以至有些小片段dna带型不易分辨。如配制2%凝胶100ml，称取琼脂糖2g于三角瓶中，加入100ml0.5×tbe液，微波炉加热2-5min，使琼脂糖*溶解（注意不要暴沸），置室温等温度下降至60℃时，加入终浓度0.5μg/ml的eb液，充分混匀后倒板（注意排除气体）。
（2）加样和电泳
上样时一般取pcr反应液5~10μl，加入3μl溴酚兰液，充分混匀，加入凝胶加样孔中。电泳仪可用一般稳压可调中压电泳仪，电泳工作液为0.5×tbe液，接通电源，使样品由负极向正极移动。60-100v恒压电泳约30-60分钟。
（3）检测
将凝胶板放在紫外透射仪的石英玻璃台上进行检测，dna产物与荧光染料eb形成橙黄色荧光复合物。观察各泳道是否有橙黄色荧光带出现，并与扩增时所设的阳性对照比较，判断阳性或阴性结果。也可在电泳时以标准分子量作对照，判断其扩增片段是否与设计的大小相一致。
2、聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳繁琐，但在引物纯化、pcr扩增指纹图、多重pcr扩增、pcr扩增产物的酶切限制性长度多态性分析时常用到。
它与琼脂糖凝胶电泳比较具有如下优点：
①分辨率很强，可达1bp；
②能装载的dna量大，达每孔10μgdna；
③回收的dna纯度高；
④其银染法的灵敏度较琼脂糖中eb染色法高2~5倍；
⑤避免了eb迅速退色的弱点，银染的凝胶干燥后可*保存。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨dna pian段的有效范围：
(1)制胶
在两块制胶玻璃板中间放上垫片，放上制胶架，拧紧制胶螺丝夹紧玻璃板。
制备适量合适浓度的凝胶，使之略多于胶板。制备100μl体积凝胶的配制方法见下表。
不同浓度（%）聚丙酰胺凝胶的制法：
试剂
3.5%
5%
8%
12%
20%
30%丙烯酰胺溶液（ml）
11.6
16.6
26.6
40
66.6
水（ml）
67.7
62.7
26.6
40
66.6
5×tbe（ml）
20
20
20
20
20
10%过硫酸铵（ml）
0.7
0.7
0.7
0.7
0.7
temed（ml）
0.035
0.035
0.035
0.035
0.035
在加入temed和10%过硫酸铵后，立即混匀，倒入放置45℃角的玻璃板内，*注满（注意不要有气泡），迅速将玻璃板放置水平位置。立即放成型梳子于腔顶并夹紧，待30-60分钟胶聚合后，取下胶板，放入电泳槽中固定。
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上下槽中加入1×tbe电泳缓冲液，溢过加样孔，拔出梳子，排出加样孔中的气泡，将pcr产物或限制性内切酶消化产物2与1上样缓冲液混匀，用微量注射器加入加样孔底部，使样品在孔底成一层，两侧孔中加入标准分子量的dnamarker。
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