研究生实验-大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化
大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化
一、实验目的
通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。获得感受态细胞；制备含有目的片段的阳性克隆。
二、实验原理
转化(transformation)是将外源dna分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(rˉ，mˉ)，它可以容忍外源dna分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，cacl2，rbcl(kcl)等化学试剂法的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源dna分子进入的感受态细胞(compenent cells)。进入受体细胞的dna分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(transformant，即带有异源dna分子的受体细胞)。cacl2 法简便易行，且其转化效率全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此cacl2法使用更广泛。
转化率的计算：
统计培养皿中的转化子数，转化后在抗生素的平板上长出的菌落即为转化子。
转化子总数=菌落数×稀释倍数（转化反应原液总体积 / 涂板菌液体积）
转化频率（转化子个数/每μg质粒dna）= 对照2转化子总数 / 质粒dna加入量（μg）
感受态细胞总数= 对照1菌落数×稀释倍数
感受态细胞转化效率= 转化子总数 / 感受态细胞总数
为了提高转化效率，实验中要考虑以下几个重要因素：
1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的od600 来控制。密度过高或不足均会影响转化效率。
2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒dna应主要是超螺旋态dna(cccdna)。转化效率与外源dna的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源dna的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。1ng的cccdna即可使50μl的感受态细胞达到饱和。一般情况下，dna溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
3. 试剂的质量: 所用的试剂，如cacl2 等均需是最高纯度的(gr.或ar.)，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。
4. 防止杂菌和杂dna的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、dna酶或杂dna所污染，否则均会影响转化效率或杂dna的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
本实验以e.coli top-10菌株为受体细胞，并用cacl2处理，使其处于感受态，然后与puc质粒共保温，实现转化。由于puc质粒带有氨苄青霉素抗性基因(ampr)，可通过amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入puc，则在含amp的培养基上不能生长。能在amp培养基上生长的受体细胞（转化子）已导入了puc。
三、主要试剂
e.coli(top-10, dh 5a)、cacl2、无菌水、胰蛋白胨、酵母粉、琼脂、氨苄青霉素。
四、仪器耗材
控温摇床(37℃)、冷冻离心机（50ml转子）、水浴锅、冰箱（-20℃，-70℃）、超净工作台、培养箱(37℃)、分光光度计、移液器、枪头、离心管、小三角瓶、6cm平皿、酒精灯、三角玻棒、酒精棉球、火柴
五、实验步骤
感受态细胞制备：
1. 第一天：从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落接于2 ml lb液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。
2. 第二天：取0.5 ml菌液转接到一个含有50 ml lb液体培养基锥形瓶中，37℃振荡培养。2-3 h，测定od600 ≤ 0.4-0.5，细胞数务必 ≤108／ml。（此为实验成功的关键)
3. 将菌液转移到50 ml离心管中，冰上放置10 min。
4. 离心10 min，4000r/min，4℃，倒出培养液，将管倒置1min以便培养液流尽，回收细胞。
5. 用冰冷的0.1 mol/l cacl210 ml悬浮沉淀，立即放在冰上30 min。
6. 4℃ 6000 r/min，离心10 min，回收细胞。
7. 用冰冷的0.1mol/l cacl22 ml悬浮细胞，务必放在冰上。此细胞为感受态细胞。
8. 分装，每管200 μl。可以加入15%甘油-70度保存。
转化：
9. 取200 μl新鲜制备的感受态细胞，加入连接产物10μl（~50 ng ）混匀冰上放置30 min。
同时作2个对照管：
对照1：200 μl感受态细胞＋ 10μl无菌水（不含氨苄皿）每班做一个
对照2：200 μl 感受态细胞＋ 1μl 标准质粒dna溶液（10ng/μl）每班做1-3个
10. 将管放到42℃循环水浴90-120sec。
11. 冰浴2 min。（提前准备好）
12. 每管加600 μl lb液体培养基，37℃培养1 h（慢摇）。
13. 将适当体积已转化的感受态细胞，离心后涂在含有氨苄青霉素的培养皿中。（提前倒好平板）
注意：对照1涂不加氨苄的平皿，菌液不离心，取1-10μl涂；
对照2涂氨苄平皿，菌液不离心，取5-20μl涂。
14. 倒置平皿37℃培养12-16 h，出现菌落。
15. 计算阳性对照的转化频率。
16. 记录样品的转化子总数。
六、注意事项
1. 无菌操作。
2. 低温操作。
3．注意加amp时的温度，温度不能过高（55-60度），否则抗生素失活，会使克隆株无法筛选出来。
苏州阿尔法实验器材有限公司14年专注于生物实验室仪器设备与实验耗材和生物试剂的专业供应商，迄今为止已服务1000+客户。主要经营的仪器类产品包括恒温振荡培养箱，二氧化碳摇床，全温振荡培养箱，振荡培养箱，rainin移液器，培养箱，霉菌培养箱，生物反应器，发酵罐，二氧化碳培养箱，液氮罐，超纯水机，天平，离心机、洁净工作台等。厂商企业授权包括知楚仪器、朗基、中科美菱，梅特勒，乐枫，搏旅、nest、天根、奥盛等80余家。如需更多了解进入 苏州阿尔法生物网站进行咨询。
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一、实验目的
通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。获得感受态细胞；制备含有目的片段的阳性克隆。
二、实验原理
转化(transformation)是将外源dna分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(rˉ，mˉ)，它可以容忍外源dna分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，cacl2，rbcl(kcl)等化学试剂法的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源dna分子进入的感受态细胞(compenent cells)。进入受体细胞的dna分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(transformant，即带有异源dna分子的受体细胞)。cacl2 法简便易行，且其转化效率全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此cacl2法使用更广泛。
转化率的计算：
统计培养皿中的转化子数，转化后在抗生素的平板上长出的菌落即为转化子。
转化子总数=菌落数×稀释倍数（转化反应原液总体积 / 涂板菌液体积）
转化频率（转化子个数/每μg质粒dna）= 对照2转化子总数 / 质粒dna加入量（μg）
感受态细胞总数= 对照1菌落数×稀释倍数
感受态细胞转化效率= 转化子总数 / 感受态细胞总数
为了提高转化效率，实验中要考虑以下几个重要因素：
1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的od600 来控制。密度过高或不足均会影响转化效率。
2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒dna应主要是超螺旋态dna(cccdna)。转化效率与外源dna的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源dna的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。1ng的cccdna即可使50μl的感受态细胞达到饱和。一般情况下，dna溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
3. 试剂的质量: 所用的试剂，如cacl2 等均需是最高纯度的(gr.或ar.)，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。
4. 防止杂菌和杂dna的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、dna酶或杂dna所污染，否则均会影响转化效率或杂dna的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
本实验以e.coli top-10菌株为受体细胞，并用cacl2处理，使其处于感受态，然后与puc质粒共保温，实现转化。由于puc质粒带有氨苄青霉素抗性基因(ampr)，可通过amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入puc，则在含amp的培养基上不能生长。能在amp培养基上生长的受体细胞（转化子）已导入了puc。
三、主要试剂
e.coli(top-10, dh 5a)、cacl2、无菌水、胰蛋白胨、酵母粉、琼脂、氨苄青霉素。
四、仪器耗材
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五、实验步骤
感受态细胞制备：
1. 第一天：从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落接于2 ml lb液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。
2. 第二天：取0.5 ml菌液转接到一个含有50 ml lb液体培养基锥形瓶中，37℃振荡培养。2-3 h，测定od600 ≤ 0.4-0.5，细胞数务必 ≤108／ml。（此为实验成功的关键)
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4. 离心10 min，4000r/min，4℃，倒出培养液，将管倒置1min以便培养液流尽，回收细胞。
5. 用冰冷的0.1 mol/l cacl210 ml悬浮沉淀，立即放在冰上30 min。
6. 4℃ 6000 r/min，离心10 min，回收细胞。
7. 用冰冷的0.1mol/l cacl22 ml悬浮细胞，务必放在冰上。此细胞为感受态细胞。
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11. 冰浴2 min。（提前准备好）
12. 每管加600 μl lb液体培养基，37℃培养1 h（慢摇）。
13. 将适当体积已转化的感受态细胞，离心后涂在含有氨苄青霉素的培养皿中。（提前倒好平板）
注意：对照1涂不加氨苄的平皿，菌液不离心，取1-10μl涂；
对照2涂氨苄平皿，菌液不离心，取5-20μl涂。
14. 倒置平皿37℃培养12-16 h，出现菌落。
15. 计算阳性对照的转化频率。
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1. 无菌操作。
2. 低温操作。
3．注意加amp时的温度，温度不能过高（55-60度），否则抗生素失活，会使克隆株无法筛选出来。
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