深入了解重组白蛋白纯化：质量、产量与成本的平衡艺术
人血清白蛋白(hsa)在生物制药行业有着广泛的应用，包括血浆扩增、配方赋形剂、药物输送、伤口愈合以及作为融合搭档延长蛋白质药物的半衰期。由于人血清白蛋白的供应有限，无法满足临床需求，因此科研人员正在寻找其他来源的白蛋白，例如通过基因工程生产重组人血清白蛋白，以及各种各样的白蛋白融合蛋白已经被生产出来，以延长融合蛋白的循环半衰期，同时保持其活性。目前，重组白蛋白的生产主要依赖于基因工程方法，通过酵母、cho细胞或大肠杆菌等表达系统表达目标蛋白，再进行分离纯化等工艺。然而，在表达和纯化过程中，存在一些技术难题，如表达水平低、翻译后修饰不完quan、纯化步骤繁琐且收率低等。
为了解决重组白蛋白融合蛋白纯化步骤繁琐且收率低的问题，astrea bioseparations与albumedix【重组白蛋白产品的生产商和白蛋白融合蛋白技术的开发商(veltis®)】合作开发了albupure®，一种高度稳定、稳健、无毒、具有高结合能力、高回收率和高纯度的亲和色谱。符合iso 9001质量标准的生产环境，可用于白蛋白及白蛋白融合蛋白的纯化和cgmp生产。albupure®是一种新型合成三嗪配基，源自astrea bioseparations的“mimetic ligand™ ”技术，并与其专lipurabead®6hf琼脂糖基质偶联。该技术提供了稳定的基架和配体，可以使用1 m naoh进行清洁，寿命较长。
albupure®性能：
ligand: synthetic triazine
adsorbent appearance: white
mean particle size: 90±10um
base matrix: highly cross-linked 6% near-monodisperse beaded agarose (purabead®6hf)
binding capacity: >35 g/l*
operational flow rate: up to 600 cm/hr
packing conditions: saline solution at a constant pressure of 1.5 bar (~22 psi)
chemical stability: stable in all commonly used buffers and solutions
sanitization: 0.5 to 1.0 m naoh, 25℃
storage: 2-30℃, 20% ethanol / 80% 0.1 m nacl (v/v)
*performed using scfv albumin fusion fermentation supernatant loading to 10% breakthrough at 240 cm/hr, ph 4.5
albupure®捕获和纯化重组白蛋白融合蛋白案例分享：材料与方法使用albupure®在自动色谱工作站上纯化albumedix酵母表达系统生产的不同白蛋白融合蛋白il-1ra和anti-hiv gp41，在上样前都经过预处理。未结合蛋白和结合不紧密的蛋白通过平衡缓冲液去除。结合的非靶标蛋白随后使用一系列增加ph的缓冲液洗脱。白蛋白融合蛋白使用含有辛酸钠的缓冲液选择性地洗脱。
表1:使用albupure®从ccs中捕获纯化il-1ra和anti-hiv gp41白蛋白融合蛋白并去除宿主细胞蛋白(hcp)的色谱条件。
*白蛋白融合蛋白-基因融合:(1) il-1ra - 18 kda(大分子量)(2) gp41 - 5 kda(小分子量)用稀乙酸调节得到ph为5.3的样品，电导率为~ 3ms /cm。
结果与讨论一、il-1ra白蛋白融合蛋白il-1ra 白蛋白融合蛋白 （~85 kda） 被 albupure®吸附剂捕获，非靶标蛋白在色谱柱中流穿。使用一系列ph值增加的缓冲液洗涤去除宿主细胞蛋白，之后使用含有辛酸钠的缓冲液选择性地从柱中洗脱白蛋白融合蛋白(图1)。通过sds-page分析工艺馏分(图2)。
图1:利用albupure®从ccs中捕获和纯化il-1ra白蛋白融合蛋白、去除hcp的色谱图。
图 2: 使用 albupure®纯化的 ccs 中 il-1ra 白蛋白融合蛋白层析组分的sds-page. lane 1: load (diluted); lane 2: ft (neat); lane 3: post load wash (neat); lane 4: wash 1 (neat); lane 5: wash 2 (neat); lane 6: wash 3 (neat); lane 7: elution (diluted); lane 8: elution (10 fold dilution of lane 7); lane 9: human albumin standard (1 µg).
sds-page 分析（图 2）表明目标蛋白较高的结合能力，非目标蛋白在流穿液和洗涤液中（lanes 2 and 3）。增加 ph 值的洗涤步骤（lanes 4 to 6）突出表明非目标蛋白大量被清除（只有少量目标蛋白流失）。洗脱部分显示出较高的il-1ra 白蛋白融合蛋白的纯度和回收率（lanes 7 and 8）。
二、anti-hiv gp41白蛋白融合蛋白使用 albupure®捕获并纯化anti-hiv gp41白蛋白融合蛋白（~72 kda）,非靶标蛋白在色谱柱中流穿。使用一系列ph值增加的缓冲液洗涤去除宿主细胞蛋白(hcp)。gp41白蛋白融合蛋白选择性用辛酸钠从柱中洗脱（图3）;过程馏分通过sds-page进行分析（图 4）。
图3:使用albupure®从ccs中捕获和纯化anti-hiv gp41白蛋白融合蛋白的色谱图
sds-page分析(图4)表明目标蛋白较高的结合能力，非目标蛋白在流穿液和洗涤液中(lanes 2 and 3)。增加 ph 值的洗涤步骤（lanes 4 to 6）突出表明非目标蛋白大量被清除（只有少量目标蛋白流失）。洗脱部分显示出较高的anti-hivgp41白蛋白融合蛋白的纯度和回收率（lanes 7 and 8）。
图 4: 使用 albupure®纯化的 ccs 中anti-hivgp41白蛋白融合蛋白层析组分的 sds-page。 lane: 1. load (diluted); lane 2: ft (neat); lane 3: post load wash (neat); lane 4: wash 1 (neat); lane 5: wash 2 (neat); lane 6: wash 3 (neat); lane 7: elution (diluted); lane 8: elution (10 fold dilution of lane 7); lane 9: human albumin standard (1 µg)
总结albupure®可用于从发酵和细胞培养上清液中捕获和纯化重组白蛋白融合蛋白，如本案例所示，具有高纯度和回收率。
albupure®吸附剂已被用于纯化各种分子量的白蛋白融合蛋白：
fusion partner approximate fusion partner mw
hiv peptides 5kda
il-1ra 18kda
endostatin 20kda
prosaptide 2.5kda
kunits domain 7kda
scfv 30kda
dab 13kda
nanobody 14kda
vnar 13kda
此外，albupure®能够以高达600厘米/小时的流速处理复杂的原料。因此，albupure吸附剂可以通过缩短处理时间来显著降低制造成本，它具有高操作流速和高结合能力，以及重复再生使用的性能。
参考资料data courtesy of albumedix ltd: use of a novel affinity matrix as a platform purification for albumin fusions, recovery of biological products xiv conference presentation, lake tahoe, california, august 1st – 6th 2010.
产品信息：
货号 品名 规格 品牌
3151-00025 albupure®(25 ml) 25ml astrea
3151-00100 albupure (100 ml) 100ml astrea
3151-00500 albupure (500 ml) 500ml astrea
3151-01000 albupure (1 l) 1l astrea
6626 albupure®4 x 1 ml 4x1ml astrea
6627 albupure®4 x 5 ml 4x5ml astrea
英国astrea bioseparations于1987年成立，公司前身是affinity chromoatography ltd，其从英国剑桥大学独立出来专注于吸附填料的研发和生产。astrea bioseparations 公司两大核心专li技术（产品）mimetic ligand®和purabead®是公司产品的基石，迄今为止已有22个上市产品（fda/ema） 使用 astrea bioseparations公司的产品用于商业化生产，其中不乏跨国公司和新兴生物技术公司。
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albupure®性能：
ligand: synthetic triazine
adsorbent appearance: white
mean particle size: 90±10um
base matrix: highly cross-linked 6% near-monodisperse beaded agarose (purabead®6hf)
binding capacity: >35 g/l*
operational flow rate: up to 600 cm/hr
packing conditions: saline solution at a constant pressure of 1.5 bar (~22 psi)
chemical stability: stable in all commonly used buffers and solutions
sanitization: 0.5 to 1.0 m naoh, 25℃
storage: 2-30℃, 20% ethanol / 80% 0.1 m nacl (v/v)
*performed using scfv albumin fusion fermentation supernatant loading to 10% breakthrough at 240 cm/hr, ph 4.5
albupure®捕获和纯化重组白蛋白融合蛋白案例分享：材料与方法使用albupure®在自动色谱工作站上纯化albumedix酵母表达系统生产的不同白蛋白融合蛋白il-1ra和anti-hiv gp41，在上样前都经过预处理。未结合蛋白和结合不紧密的蛋白通过平衡缓冲液去除。结合的非靶标蛋白随后使用一系列增加ph的缓冲液洗脱。白蛋白融合蛋白使用含有辛酸钠的缓冲液选择性地洗脱。
表1:使用albupure®从ccs中捕获纯化il-1ra和anti-hiv gp41白蛋白融合蛋白并去除宿主细胞蛋白(hcp)的色谱条件。
*白蛋白融合蛋白-基因融合:(1) il-1ra - 18 kda(大分子量)(2) gp41 - 5 kda(小分子量)用稀乙酸调节得到ph为5.3的样品，电导率为~ 3ms /cm。
结果与讨论一、il-1ra白蛋白融合蛋白il-1ra 白蛋白融合蛋白 （~85 kda） 被 albupure®吸附剂捕获，非靶标蛋白在色谱柱中流穿。使用一系列ph值增加的缓冲液洗涤去除宿主细胞蛋白，之后使用含有辛酸钠的缓冲液选择性地从柱中洗脱白蛋白融合蛋白(图1)。通过sds-page分析工艺馏分(图2)。
图1:利用albupure®从ccs中捕获和纯化il-1ra白蛋白融合蛋白、去除hcp的色谱图。
图 2: 使用 albupure®纯化的 ccs 中 il-1ra 白蛋白融合蛋白层析组分的sds-page. lane 1: load (diluted); lane 2: ft (neat); lane 3: post load wash (neat); lane 4: wash 1 (neat); lane 5: wash 2 (neat); lane 6: wash 3 (neat); lane 7: elution (diluted); lane 8: elution (10 fold dilution of lane 7); lane 9: human albumin standard (1 µg).
sds-page 分析（图 2）表明目标蛋白较高的结合能力，非目标蛋白在流穿液和洗涤液中（lanes 2 and 3）。增加 ph 值的洗涤步骤（lanes 4 to 6）突出表明非目标蛋白大量被清除（只有少量目标蛋白流失）。洗脱部分显示出较高的il-1ra 白蛋白融合蛋白的纯度和回收率（lanes 7 and 8）。
二、anti-hiv gp41白蛋白融合蛋白使用 albupure®捕获并纯化anti-hiv gp41白蛋白融合蛋白（~72 kda）,非靶标蛋白在色谱柱中流穿。使用一系列ph值增加的缓冲液洗涤去除宿主细胞蛋白(hcp)。gp41白蛋白融合蛋白选择性用辛酸钠从柱中洗脱（图3）;过程馏分通过sds-page进行分析（图 4）。
图3:使用albupure®从ccs中捕获和纯化anti-hiv gp41白蛋白融合蛋白的色谱图
sds-page分析(图4)表明目标蛋白较高的结合能力，非目标蛋白在流穿液和洗涤液中(lanes 2 and 3)。增加 ph 值的洗涤步骤（lanes 4 to 6）突出表明非目标蛋白大量被清除（只有少量目标蛋白流失）。洗脱部分显示出较高的anti-hivgp41白蛋白融合蛋白的纯度和回收率（lanes 7 and 8）。
图 4: 使用 albupure®纯化的 ccs 中anti-hivgp41白蛋白融合蛋白层析组分的 sds-page。 lane: 1. load (diluted); lane 2: ft (neat); lane 3: post load wash (neat); lane 4: wash 1 (neat); lane 5: wash 2 (neat); lane 6: wash 3 (neat); lane 7: elution (diluted); lane 8: elution (10 fold dilution of lane 7); lane 9: human albumin standard (1 µg)
总结albupure®可用于从发酵和细胞培养上清液中捕获和纯化重组白蛋白融合蛋白，如本案例所示，具有高纯度和回收率。
albupure®吸附剂已被用于纯化各种分子量的白蛋白融合蛋白：
fusion partner approximate fusion partner mw
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il-1ra 18kda
endostatin 20kda
prosaptide 2.5kda
kunits domain 7kda
scfv 30kda
dab 13kda
nanobody 14kda
vnar 13kda
此外，albupure®能够以高达600厘米/小时的流速处理复杂的原料。因此，albupure吸附剂可以通过缩短处理时间来显著降低制造成本，它具有高操作流速和高结合能力，以及重复再生使用的性能。
参考资料data courtesy of albumedix ltd: use of a novel affinity matrix as a platform purification for albumin fusions, recovery of biological products xiv conference presentation, lake tahoe, california, august 1st – 6th 2010.
产品信息：
货号 品名 规格 品牌
3151-00025 albupure®(25 ml) 25ml astrea
3151-00100 albupure (100 ml) 100ml astrea
3151-00500 albupure (500 ml) 500ml astrea
3151-01000 albupure (1 l) 1l astrea
6626 albupure®4 x 1 ml 4x1ml astrea
6627 albupure®4 x 5 ml 4x5ml astrea
英国astrea bioseparations于1987年成立，公司前身是affinity chromoatography ltd，其从英国剑桥大学独立出来专注于吸附填料的研发和生产。astrea bioseparations 公司两大核心专li技术（产品）mimetic ligand®和purabead®是公司产品的基石，迄今为止已有22个上市产品（fda/ema） 使用 astrea bioseparations公司的产品用于商业化生产，其中不乏跨国公司和新兴生物技术公司。
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