蛔虫卵测定方法
水质 蛔虫卵的测定 沉淀集卵法
蛔虫卵测定适用范围：
本标准规定了测定水中蛔虫卵的沉淀集卵法。
本校准适用于地表水和废水中的蛔虫卵测定。
当取样体积为10l时，本方法的检出限为5个/10l（注：不锈钢开口直壁容器应选择10l带刻度）
规范性引用文件
本标准内容引用了下列文件或其中的条款。凡是不注明日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。
hj/t 91地表水和污水检测技术规范
方法原理：
沉淀集卵法主要通过样品的浓缩、杂质分离、镜检计数等环节对水中的蛔虫卵进行测定。用60目全不锈钢筛网过滤去除样品中交大的杂质，利用蛔虫卵比重大于水和易于沉淀的特性过夜沉淀浓缩水样，用虹吸的放大弃去上清液，用表面活性剂吐温80作为残液及沉淀转移时的清洗剂，进一步离心浓缩转移的剩余物，收集到的浓缩物用乙酸-乙酸钠缓冲液混匀，控制溶液ph值，获得亲水-亲脂平衡，加入乙酸乙酯吸收水中的脂肪类杂质，使蛔虫卵更容易下沉。再次离心浓缩样品并弃去上部脂肪杂质层级缓冲液层，获得的含卵沉淀层用饱和硝酸钠溶液混匀，于计数框中静置漂浮后镜检，即可测得水样中蛔虫卵的数量。
配套试剂和材料：
分析时请使用符合标准的分析纯化学试剂，试验用水为新制备的蒸馏水或者去离子水。
一：乙酸乙酯（c4h8o2）
二：乙酸-乙酸钠缓冲液：ph=4.5
称取15.0g三水合乙酸钠(ch3coona3h2o) ，溶于约800 ml实验用水中，加入3.6 ml乙酸(ch;cooh)调节ph值至4.5， 用实验用水定容至1000 ml。此溶液保质期为30d。
三：吐温80溶液: q (c24h4o6) =1 %o。
移取1ml吐温80(tween80)，用实验用水稀释定容至1000ml,临用现配。
四：饱和硝酸钠(nano3) 溶液
称取略多于实验环境温度对应溶解度的硝酸钠(nano3),充分溶解于100g实验用水中，用滤纸滤去残渣，临用现配。硝酸钠在不同温度下的溶解度见附录a。
配套仪器和耗材：
分析时如有量器请使用符合标准的a级量器
一：显微镜：物镜4x、10倍，目镜10x倍
二：冰箱：0℃-4℃
三：水平转子离心机：带50ml螺口尖底离心管，离心力1000g以上
四：漩涡混合器
五：筛网：60目 ，孔径250um
六：不锈钢开口直壁容器10l（带刻度
七：开口直壁量筒：1000ml a级
八：虹吸管
九：洗瓶
十：螺口尖底离心管50ml
十一：一次性巴氏滴管3ml、10ml
十二：微移液器：1000ul
十三：定量计数框：1ml网格、5ml型
样品：
按hj/t 91中对一般污染物采样的要求，用10 l以上容积的塑料桶采样。采样前需用样品荡洗塑料桶，采集样品量应≥10l,常温下运回实验室，立即进行过滤(7.1)和沉淀(7.2)。
分析步骤：
一：过滤
充分摇匀样品，转入不锈钢开口直壁容器至10l刻度。如样品中含有草梗、纸渣等较大杂质，需将样品用筛网过滤，并用吐温80溶液清洗筛网及杂质，洗液并入过滤后的10l样品中。
二：沉淀
上述样品在15 c~25 c室温下静置过夜沉淀12 h~24 h,用虹吸管小心吸取并弃去上清液，避免扰动，保留1 l含沉淀物的样品，转入1000 ml开口直壁量筒，分别用50 ml吐温80溶液*清洗不锈钢开口直壁容器3次，洗液并入开口直壁量筒。在15 c~25 c室温下再次静置过夜沉淀12h~24h,用虹吸管吸取并弃去上清液，避免扰动，保留90 ml~ 100 ml含沉淀物的样品。
注1:若样品中蛔虫卵浓度在10倍检出限以上(>50个/10l),采样时，可只采总量不小于1l的样品，取1l水样直接进行第二步的量筒沉淀浓缩。当样品中含有草梗、纸渣等较大杂质，同样应先将样品用筛网过滤，并用吐温80溶液清洗筛网及杂质，洗液并入1 l样品中沉淀。
离心：
沉淀浓缩后的样品(7.2) 小心转移至3个螺口尖底离心管，分别用15 ml 吐温80溶液*清洗开口直壁量筒3次，洗液均匀并入3个螺口尖底离心管。以1000g 的离心力(离心机转速计算见附录a)离心15 min,用巴氏滴管小心吸取并弃去，上清液，少量留之，避免带出沉淀。
用少量吐温80溶液将3个离心管中的沉淀进行悬浮，将沉淀量少的2个离心管中的悬浮液并入沉淀量多的一个离心管中:分别用3 ml~ 5 ml吐温80溶液*清洗被转移悬浮液的2个离心管，每支清洗3次，确保没有沉淀被丢弃，洗液并入沉淀量多的离心管。以1000g的离心力离心15min,用巴氏滴管小心吸取并弃去上清液，少量留之，避免带出沉淀。
脂类杂质分离去除：
用与离心后沉淀等体积的乙酸-乙酸钠缓冲液对沉淀进行悬浮(即:离心后沉淀体积为2 ml,加入2ml缓冲液。如果离心后沉淀体积不足2ml,加入缓冲液至4 ml。以确保用乙酸乙酯浸提后，沉淀上方有足够体积的缓冲液，便于脂类杂质层*倾出，且避免蛔虫卵沉淀层的丢失。
加入2倍离心后沉淀体积的乙酸乙酯，用涡旋混匀器*混合。以.1000g的离心力离心15 min， 样品被分为清晰的三层。所有的非脂肪物质、重碎片，包括蛔虫卵、幼虫和原生动物在底层;中间层是缓冲液层;脂肪和其他脂溶性物质在上方形成黑而厚的一层。
将上层和中间层液体平稳倾出弃去，记录底层沉淀体积。如有必要，可用细针在离心管壁四周对上层的脂肪层进行松动。
镜检：
加入5倍底层沉淀(7.4)体积的饱和硝酸钠溶液，对分离去除脂类杂质后的含卵底层沉淀进行悬浮。该悬浮液可置于0 c~4 c冰箱冷藏保存，备检，于1周内检测完毕，检测时需将其静置至室温。充分摇匀悬浮液，将其转入定量计数框静置5 min,在显微镜下计数，直至全部悬浮液镜检完成。分别用1 ml饱和硝酸钠溶液充分洗涤镜检完的离心管3次，将洗液转入定量计数框，按以上步骤镜检。所有检测到的蛔虫卵全部计数。
镜检时，需保持环境条件的稳定，无震动和风扰，缓移计数框，自上而下“u”型逐列计数。蛔虫卵鉴定方法见附录b。
空白对照试验：
取10l同批次试验用水，按以上采样及分析步骤进行全程序样品的测定。
结果计算于表示：
计算结果：
c------水样中蛔虫卵浓度（个/10l）
n-----检测到的所有蛔虫卵数（个）
q-----实际水样体积（10l）
结果表示：
水质中蛔虫卵的测定，实验终结果取整数，以“个/10l”为单位
精密度：
6家实验室分别对实际样品和低浓度(20 个/10l)、中浓度(40 个/10l)、高浓度(80个/10l)自配样品的蛔虫卵进行测定，实验室内相对标准偏差范围分别为:6.5%~18.9%，10.1%~22.0%，12.8%~23.8%， 8.9%~ 17.4%;实验室间相对标准偏差分别为5.8%、5. 5%、4.9%、4.8%; 重复性限(个/10l)为244、3、7、11;再现性限(个/10l)为260、3、7、11。
质量保证和质量控制：
每批次样品至少做1个全程序空白实验，并取10%的样品进行平行样测定，全程序空白实验不得检出蛔虫卵，平行样间的相对偏差不得超过30%。
废物处理：
实验中虹吸液煮沸10min后可按普通废弃物处理，含乙酸乙酯的废弃液应集中保管，委托有资质的单位进行处理。
注意事项：
实验用过的器具均需进行高温灭活，置于水中煮沸10min后方可再次使用。
实验操作人员要注意自身防护，试验时要穿戴工作服、乳胶手套、及口罩等，同时还要避免蛔虫卵的样品污染实验室环境。
附录a
硝酸钠水中溶解度、离心机离心力及转速计算公式
a.1 硝酸钠在水中的溶解度
表a.1 硝酸钠水中溶解度
温度（℃）
溶解度（g）
0
73
10
80
20
87
30
95
40
103
a.2离心力计算公式：
附录b
蛔虫卵的检定
b.1蛔虫卵的形态特征
b.1.1受精蛔虫卵
虫卵呈短椭圆形，大小为45 μm~75 μmx35 μm~ 50 μm。卵壳很厚，自外向内分为三层:受精膜、壳质层和蛔甙层，壳质层较厚，另两层极薄，在普通显微镜下难以分清。卵壳内有一个大而圆未分裂的受精卵细胞，与卵壳间常见有新月形空隙。卵壳外有一层由虫体子宫分泌形成的蛋白质膜，其表面凹凸不平呈波浪状。随粪便排出的虫卵常被胆汁染成黄色或棕褐色。
b.1.2未受精蛔虫卵
虫卵呈长椭圆形或不规则形，大小为88 μm~94 μmx39 μm ~44 μm，卵壳与蛋自质膜均较受精蛔虫卵薄，淡黄色，无蛔甙层，卵壳内含有许多大小不一的屈光颗粒。
b.1.3感染期蛔虫卵
卵内含有一.条卷曲的幼虫。
b.1.4蛋白质膜脱落的蛔虫卵
若蛔虫卵的蛋白质膜脱落，卵壳则呈无色透明，应注意与其他线虫卵的鉴别。
b.2蛔虫卵参考图片
b.2.1蛔虫卵模式图
b.2.2发育各阶段的蛔虫卵
附录c
蛔虫卵配置样品的制备
猪蛔虫(ascaris suum)活成虫采集自屠宰场，用蒸馏水洗涤干净后，放置于含4 %*内，0 c~4 c保存备用，可*保存。
制备蛔虫卵备用液时，选取2~3条雌性蛔虫，用75 %乙醇消毒过的*，划开虫体，每条蛔虫一- 对子宫选取靠近阴门的一段(2 mm~3 mm),解剖后，将含蛔虫卵的内容物及组织碎片放入50ml离心管中，加入数颗直径1mm玻璃珠及10ml生理盐水，混匀后于涡旋混匀器振荡3min~5min,用260目网过筛，取40ml生理盐水分数次冲洗离心管和筛网，此时获得的滤液中蛔虫卵呈单个状态存在。滤液加入甲醛至终浓度为4%，0 c~4 c保存备用，可保存1个月。即制即用时可不添加甲醛。
制备配制样品时，摇匀蛔虫卵备用液，用1000 μ1微量移液器，立即吸取适量的蛔虫卵备用液于1ml定量计数框(网格)中，计数后用250μl微量移液器向计数框中添加或移出蛔虫卵至所需数量。将计数框中所有的液体用吐温80溶液冲洗入配制样品中。再在显微镜下检测计数框，确保无蛔虫卵残留。
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本标准规定了测定水中蛔虫卵的沉淀集卵法。
本校准适用于地表水和废水中的蛔虫卵测定。
当取样体积为10l时，本方法的检出限为5个/10l（注：不锈钢开口直壁容器应选择10l带刻度）
规范性引用文件
本标准内容引用了下列文件或其中的条款。凡是不注明日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。
hj/t 91地表水和污水检测技术规范
方法原理：
沉淀集卵法主要通过样品的浓缩、杂质分离、镜检计数等环节对水中的蛔虫卵进行测定。用60目全不锈钢筛网过滤去除样品中交大的杂质，利用蛔虫卵比重大于水和易于沉淀的特性过夜沉淀浓缩水样，用虹吸的放大弃去上清液，用表面活性剂吐温80作为残液及沉淀转移时的清洗剂，进一步离心浓缩转移的剩余物，收集到的浓缩物用乙酸-乙酸钠缓冲液混匀，控制溶液ph值，获得亲水-亲脂平衡，加入乙酸乙酯吸收水中的脂肪类杂质，使蛔虫卵更容易下沉。再次离心浓缩样品并弃去上部脂肪杂质层级缓冲液层，获得的含卵沉淀层用饱和硝酸钠溶液混匀，于计数框中静置漂浮后镜检，即可测得水样中蛔虫卵的数量。
配套试剂和材料：
分析时请使用符合标准的分析纯化学试剂，试验用水为新制备的蒸馏水或者去离子水。
一：乙酸乙酯（c4h8o2）
二：乙酸-乙酸钠缓冲液：ph=4.5
称取15.0g三水合乙酸钠(ch3coona3h2o) ，溶于约800 ml实验用水中，加入3.6 ml乙酸(ch;cooh)调节ph值至4.5， 用实验用水定容至1000 ml。此溶液保质期为30d。
三：吐温80溶液: q (c24h4o6) =1 %o。
移取1ml吐温80(tween80)，用实验用水稀释定容至1000ml,临用现配。
四：饱和硝酸钠(nano3) 溶液
称取略多于实验环境温度对应溶解度的硝酸钠(nano3),充分溶解于100g实验用水中，用滤纸滤去残渣，临用现配。硝酸钠在不同温度下的溶解度见附录a。
配套仪器和耗材：
分析时如有量器请使用符合标准的a级量器
一：显微镜：物镜4x、10倍，目镜10x倍
二：冰箱：0℃-4℃
三：水平转子离心机：带50ml螺口尖底离心管，离心力1000g以上
四：漩涡混合器
五：筛网：60目 ，孔径250um
六：不锈钢开口直壁容器10l（带刻度
七：开口直壁量筒：1000ml a级
八：虹吸管
九：洗瓶
十：螺口尖底离心管50ml
十一：一次性巴氏滴管3ml、10ml
十二：微移液器：1000ul
十三：定量计数框：1ml网格、5ml型
样品：
按hj/t 91中对一般污染物采样的要求，用10 l以上容积的塑料桶采样。采样前需用样品荡洗塑料桶，采集样品量应≥10l,常温下运回实验室，立即进行过滤(7.1)和沉淀(7.2)。
分析步骤：
一：过滤
充分摇匀样品，转入不锈钢开口直壁容器至10l刻度。如样品中含有草梗、纸渣等较大杂质，需将样品用筛网过滤，并用吐温80溶液清洗筛网及杂质，洗液并入过滤后的10l样品中。
二：沉淀
上述样品在15 c~25 c室温下静置过夜沉淀12 h~24 h,用虹吸管小心吸取并弃去上清液，避免扰动，保留1 l含沉淀物的样品，转入1000 ml开口直壁量筒，分别用50 ml吐温80溶液*清洗不锈钢开口直壁容器3次，洗液并入开口直壁量筒。在15 c~25 c室温下再次静置过夜沉淀12h~24h,用虹吸管吸取并弃去上清液，避免扰动，保留90 ml~ 100 ml含沉淀物的样品。
注1:若样品中蛔虫卵浓度在10倍检出限以上(>50个/10l),采样时，可只采总量不小于1l的样品，取1l水样直接进行第二步的量筒沉淀浓缩。当样品中含有草梗、纸渣等较大杂质，同样应先将样品用筛网过滤，并用吐温80溶液清洗筛网及杂质，洗液并入1 l样品中沉淀。
离心：
沉淀浓缩后的样品(7.2) 小心转移至3个螺口尖底离心管，分别用15 ml 吐温80溶液*清洗开口直壁量筒3次，洗液均匀并入3个螺口尖底离心管。以1000g 的离心力(离心机转速计算见附录a)离心15 min,用巴氏滴管小心吸取并弃去，上清液，少量留之，避免带出沉淀。
用少量吐温80溶液将3个离心管中的沉淀进行悬浮，将沉淀量少的2个离心管中的悬浮液并入沉淀量多的一个离心管中:分别用3 ml~ 5 ml吐温80溶液*清洗被转移悬浮液的2个离心管，每支清洗3次，确保没有沉淀被丢弃，洗液并入沉淀量多的离心管。以1000g的离心力离心15min,用巴氏滴管小心吸取并弃去上清液，少量留之，避免带出沉淀。
脂类杂质分离去除：
用与离心后沉淀等体积的乙酸-乙酸钠缓冲液对沉淀进行悬浮(即:离心后沉淀体积为2 ml,加入2ml缓冲液。如果离心后沉淀体积不足2ml,加入缓冲液至4 ml。以确保用乙酸乙酯浸提后，沉淀上方有足够体积的缓冲液，便于脂类杂质层*倾出，且避免蛔虫卵沉淀层的丢失。
加入2倍离心后沉淀体积的乙酸乙酯，用涡旋混匀器*混合。以.1000g的离心力离心15 min， 样品被分为清晰的三层。所有的非脂肪物质、重碎片，包括蛔虫卵、幼虫和原生动物在底层;中间层是缓冲液层;脂肪和其他脂溶性物质在上方形成黑而厚的一层。
将上层和中间层液体平稳倾出弃去，记录底层沉淀体积。如有必要，可用细针在离心管壁四周对上层的脂肪层进行松动。
镜检：
加入5倍底层沉淀(7.4)体积的饱和硝酸钠溶液，对分离去除脂类杂质后的含卵底层沉淀进行悬浮。该悬浮液可置于0 c~4 c冰箱冷藏保存，备检，于1周内检测完毕，检测时需将其静置至室温。充分摇匀悬浮液，将其转入定量计数框静置5 min,在显微镜下计数，直至全部悬浮液镜检完成。分别用1 ml饱和硝酸钠溶液充分洗涤镜检完的离心管3次，将洗液转入定量计数框，按以上步骤镜检。所有检测到的蛔虫卵全部计数。
镜检时，需保持环境条件的稳定，无震动和风扰，缓移计数框，自上而下“u”型逐列计数。蛔虫卵鉴定方法见附录b。
空白对照试验：
取10l同批次试验用水，按以上采样及分析步骤进行全程序样品的测定。
结果计算于表示：
计算结果：
c------水样中蛔虫卵浓度（个/10l）
n-----检测到的所有蛔虫卵数（个）
q-----实际水样体积（10l）
结果表示：
水质中蛔虫卵的测定，实验终结果取整数，以“个/10l”为单位
精密度：
6家实验室分别对实际样品和低浓度(20 个/10l)、中浓度(40 个/10l)、高浓度(80个/10l)自配样品的蛔虫卵进行测定，实验室内相对标准偏差范围分别为:6.5%~18.9%，10.1%~22.0%，12.8%~23.8%， 8.9%~ 17.4%;实验室间相对标准偏差分别为5.8%、5. 5%、4.9%、4.8%; 重复性限(个/10l)为244、3、7、11;再现性限(个/10l)为260、3、7、11。
质量保证和质量控制：
每批次样品至少做1个全程序空白实验，并取10%的样品进行平行样测定，全程序空白实验不得检出蛔虫卵，平行样间的相对偏差不得超过30%。
废物处理：
实验中虹吸液煮沸10min后可按普通废弃物处理，含乙酸乙酯的废弃液应集中保管，委托有资质的单位进行处理。
注意事项：
实验用过的器具均需进行高温灭活，置于水中煮沸10min后方可再次使用。
实验操作人员要注意自身防护，试验时要穿戴工作服、乳胶手套、及口罩等，同时还要避免蛔虫卵的样品污染实验室环境。
附录a
硝酸钠水中溶解度、离心机离心力及转速计算公式
a.1 硝酸钠在水中的溶解度
表a.1 硝酸钠水中溶解度
温度（℃）
溶解度（g）
0
73
10
80
20
87
30
95
40
103
a.2离心力计算公式：
附录b
蛔虫卵的检定
b.1蛔虫卵的形态特征
b.1.1受精蛔虫卵
虫卵呈短椭圆形，大小为45 μm~75 μmx35 μm~ 50 μm。卵壳很厚，自外向内分为三层:受精膜、壳质层和蛔甙层，壳质层较厚，另两层极薄，在普通显微镜下难以分清。卵壳内有一个大而圆未分裂的受精卵细胞，与卵壳间常见有新月形空隙。卵壳外有一层由虫体子宫分泌形成的蛋白质膜，其表面凹凸不平呈波浪状。随粪便排出的虫卵常被胆汁染成黄色或棕褐色。
b.1.2未受精蛔虫卵
虫卵呈长椭圆形或不规则形，大小为88 μm~94 μmx39 μm ~44 μm，卵壳与蛋自质膜均较受精蛔虫卵薄，淡黄色，无蛔甙层，卵壳内含有许多大小不一的屈光颗粒。
b.1.3感染期蛔虫卵
卵内含有一.条卷曲的幼虫。
b.1.4蛋白质膜脱落的蛔虫卵
若蛔虫卵的蛋白质膜脱落，卵壳则呈无色透明，应注意与其他线虫卵的鉴别。
b.2蛔虫卵参考图片
b.2.1蛔虫卵模式图
b.2.2发育各阶段的蛔虫卵
附录c
蛔虫卵配置样品的制备
猪蛔虫(ascaris suum)活成虫采集自屠宰场，用蒸馏水洗涤干净后，放置于含4 %*内，0 c~4 c保存备用，可*保存。
制备蛔虫卵备用液时，选取2~3条雌性蛔虫，用75 %乙醇消毒过的*，划开虫体，每条蛔虫一- 对子宫选取靠近阴门的一段(2 mm~3 mm),解剖后，将含蛔虫卵的内容物及组织碎片放入50ml离心管中，加入数颗直径1mm玻璃珠及10ml生理盐水，混匀后于涡旋混匀器振荡3min~5min,用260目网过筛，取40ml生理盐水分数次冲洗离心管和筛网，此时获得的滤液中蛔虫卵呈单个状态存在。滤液加入甲醛至终浓度为4%，0 c~4 c保存备用，可保存1个月。即制即用时可不添加甲醛。
制备配制样品时，摇匀蛔虫卵备用液，用1000 μ1微量移液器，立即吸取适量的蛔虫卵备用液于1ml定量计数框(网格)中，计数后用250μl微量移液器向计数框中添加或移出蛔虫卵至所需数量。将计数框中所有的液体用吐温80溶液冲洗入配制样品中。再在显微镜下检测计数框，确保无蛔虫卵残留。
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