蛋白表达的常见问题有哪些？
蛋白表达实验的时，有时候实验会觉得参考实验方法和克隆的蛋白基因序列wan全没有问题，但蛋白电泳就是没有结果。下面让我们一起来看看蛋白表达的常见问题有哪些吧！
1、载体构建错误，很多克隆新人经常弄错读码框。比如qiagen的pqe系列载体，其克隆位点常有一两个碱基的区别；另外有些酶产生粘端有些酶产生平端，这些都容易导致读码框错误，从而表达不出来。
2、宿主菌选择不当，不同的宿主菌其基因型是不一样的。有些经过特殊修饰的载体，或者特殊用途的载体，或者有特殊启动子的载体，必须选择合适的宿主菌进行表达。因此，当你的蛋白没有表达出来时，可以考虑更换宿主菌。
3、密码子的使用频率低。有些基因其本身含有许多稀有密码子，尤其是起始密码之后的15个碱基之内的稀有密码子，对蛋白表达有着很重要的影响。优化密码子对原核表达似乎效果很好，对真核表达系统未见得有很好的效果。
4、质粒不稳定或者质粒丢失。pet系统通常比较稳定。但是你选用带氨苄青霉素抗性的载体时，也许有可能产生β-lactamase降解了抗生素，使质粒丢失。还有一种情况是表达重组的毒素蛋白，对宿主细胞也有毒性，造成质粒丢失。这种情况多见于真核表达系统。
5、蛋白酶将蛋白降解了。这种情况常由重组蛋白本身的n-或c-端序列引起的。当蛋白n-端是arg, leu, lys, phe, trp,或 tyr这些氨基酸时，容易遭受蛋白酶降解，此即n-末端规则。n-端是met时，大肠杆菌可以悄悄地把这个met偷走，特别是met后紧跟着一个带小侧链的氨基酸时。c-末端存在非极性氨基酸时，也容易导致蛋白被降解。c末端最后5个氨基酸是极性的或者带电荷的，则不易被降解。
6、二级翻译起始位点。这种情况见于你的序列里正好含有和核糖体结合位点wan全一致的序列。那就怪不得人家了，核糖体会很高兴地找到这个位点，然后开始翻译，致使你的蛋白被截短，在电泳时看不到预期大小的片段。
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4、质粒不稳定或者质粒丢失。pet系统通常比较稳定。但是你选用带氨苄青霉素抗性的载体时，也许有可能产生β-lactamase降解了抗生素，使质粒丢失。还有一种情况是表达重组的毒素蛋白，对宿主细胞也有毒性，造成质粒丢失。这种情况多见于真核表达系统。
5、蛋白酶将蛋白降解了。这种情况常由重组蛋白本身的n-或c-端序列引起的。当蛋白n-端是arg, leu, lys, phe, trp,或 tyr这些氨基酸时，容易遭受蛋白酶降解，此即n-末端规则。n-端是met时，大肠杆菌可以悄悄地把这个met偷走，特别是met后紧跟着一个带小侧链的氨基酸时。c-末端存在非极性氨基酸时，也容易导致蛋白被降解。c末端最后5个氨基酸是极性的或者带电荷的，则不易被降解。
6、二级翻译起始位点。这种情况见于你的序列里正好含有和核糖体结合位点wan全一致的序列。那就怪不得人家了，核糖体会很高兴地找到这个位点，然后开始翻译，致使你的蛋白被截短，在电泳时看不到预期大小的片段。
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