分享一下超微量分光光度计在核酸定量上的应用
今天跟大家分享一下超微量分光光度计在核酸定量上的应用
核酸的定量是超微量分光光度计使用频率的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链dna，以及rna。
核酸的吸收峰的吸收波长260 nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如:1od 的吸光值分别相当于50μg/ml的dsdna，37μg/ml的ssdna，40μg/ml的rna，30μg/ml的olig。
测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。
事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。如德国伯赫colibri超微量分光光度计的准确度≤1.0%(1a)。这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动，都是正常的。
另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的ph值，离子浓度等:在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用ph值一定、离子浓度较低的缓冲液，如te，可大大稳定读数。
样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素:由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。
为了大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1a，吸光值好在0.1-1.5a。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高(超过光度计的测试范围)。后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值;混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈;
必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大;换算系数和样品浓度单位选择一致;不能采用窗口磨损的比色杯;样品的体积必须达到比色杯要求的小体积等多个操作事项。
除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如a260/a280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品，比值大于1.8(dna)或者2.0(rna)。
如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。a230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，*等，较纯净的核酸a260/a230的比值大于2.0。a320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，a320一般是0。
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测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。
事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。如德国伯赫colibri超微量分光光度计的准确度≤1.0%(1a)。这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动，都是正常的。
另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的ph值，离子浓度等:在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用ph值一定、离子浓度较低的缓冲液，如te，可大大稳定读数。
样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素:由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。
为了大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1a，吸光值好在0.1-1.5a。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高(超过光度计的测试范围)。后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值;混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈;
必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大;换算系数和样品浓度单位选择一致;不能采用窗口磨损的比色杯;样品的体积必须达到比色杯要求的小体积等多个操作事项。
除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如a260/a280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品，比值大于1.8(dna)或者2.0(rna)。
如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。a230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，*等，较纯净的核酸a260/a230的比值大于2.0。a320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，a320一般是0。
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