Q Exactive 高分辨质谱平台对培非格司亭及其生物类似药进行对比
1、前沿：粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，g-csf)是肿瘤病人*后提升白细胞的标准疗法，其 中重组人粒细胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte colony-stimulating factor，rhg-csf)已经广泛应用于* 和放疗引起的白细胞数减少症[1]。成熟的内源性人粒细胞集落刺 激因子（g-csf)由174个氨基酸构成，分子量为18-20kda。 利 用基因工程技术，amgen公司在1991年上市了大肠杆菌发酵的 短效版g-csf非格司亭（neupogen），2001年上市了*版 g-csf培非格司亭（peglgrastim，neulasta）。neupogen和 neulasta两者的区别在于*版使用了peg的修饰技术，使csf 的分子量和体积变大，延长了半衰期，从而把*周期内的注 射次数从7-10次减少到1次注射，增加了临床使用的便利[2]
peg修饰使蛋白相邻电荷态之间叠加非常严重[3,4]，为了降低蛋 白电荷数，需要在色谱流动相中使用三氟yi酸（tfa），取代 常用的甲酸（fa），使样品m/z向高质量端移动，从而减少相 邻电荷态之间的信号叠加；在质谱中peg修饰的蛋白会发生去 peg化，为了避免此种情况，要在柱后添加三乙基胺（tea） ；tea同时也可以起到降低蛋白电荷态的作用[5]。
实验方法 仪器及试剂 • thermo™ q exactive hf-x hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer • thermo™ ulimate3000 3400rs uhplc system • thermo scientic™ hypersil gold™ c18 column, 1.5 μm, 2.1 × 150 mm• thermo scientic™ acetonitrile, uhplc-ms grade thermo scientic™ pierce™ triuoroacetic acid, sequencing grade sigma-aldrich triethylamine, ≥99%
实验样品 总共两个peg-rhg-csf类样品，一个是原研药neulasta，另一 个是仿制药biosimilar。样品均为无色澄清溶液。 样品前处理步骤 以millipore water将两个样品分别稀释至1mg/ml后上lc-ms平 台分析，测定其完整分子量。
实验方法设置 液相色谱实验条件： 流动相：a(50%acn+0.1%tfa), b(95%acn+0.1%tfa) ； 柱温：50℃； 流速：0.3ml/min; postcolumn-addition: 400mm tea in water, 5μl/min; 上样量：1μg. 色谱梯度如表1所示；为减少tea及tfa对质谱系统的污 染，3min之后的组分均通过质谱自带六通阀切入废液。
数据处理软件 使用thermo scientic biopharma finder 3.2软件进行完整分子 量分析，实验参数如图1所示。
图3展示了neulasta样品在分辨率15000/120000下的解卷积 结果。分辨率=15000时，总共检测到181个组分。由图中可 见，随分辨率增高，相邻组分之间得到更好分离；当分辨率为 15000时，对于npeg=483的组分，其理论与实测分子量偏差 为-2.26da；当分辨率为120000时，对于npeg=483的组分， 其理论与实测分子量偏差为0.35da。可见随着分辨率的增高， 可将分子量相近的组分分离开（上右图中红线与蓝线所示的两 个组分），从而提高分子量测定的准确度。
同样由于peg修饰，导致样品高度复杂。对其进行解卷积处理 （图5），在15000分辨率下共检测到141个组分，同样呈正态 分布，选取局部区域放大观察，各个组分之间均实现了基线分 离（局部放大图）
使用biopharma finder软件对原研药和类似药进行镜像图对 比，可见相比于原研药，生物类似药的分布整体向高质量端 平移，说明修饰的peg链分布不同。根据前述公式分别计算两 个样品的mn，mm和pd，结果如表3所示。由表3中可以明显 看出，由于修饰peg链的分布不同，导致原研药和类似药的 mn ，mm和pd均有差异。
结论 ：在本文的研究中，我们在赛默飞q exactive hf-x平台上对peg修饰的 neulasta及其生物类似药分子量进行了测定，并计算了其数均 分子量、质均分子量和peg多分散性，以评估类似药与原研药 的相似程度。从结果中可以看出，相比于原研药，生物类似药 的分子量整体向高质量端平移，表明peg修饰链的分布有所差 异；得益于orbitrap高分辨质谱平台的优异性能，对于高度复杂 的peg修饰样品，仍然能够实现相邻质谱峰间的基线分离，从 而准确测得其分子量用以评估peg修饰链的分布，从而对产品 进行评估。
参考文献 1 lyman gh, dale dc, culakova e, poniewierski ms, wolff da, kuderer nm, huang m, crawford j. annals of oncology. 24 (10): 2475–84. 2 harris, j. m.; chess, r. b. nat. rev. drug discovery 2003, 2, 214−21. 3 mann, m.; meng, c. k.; fenn, j. b. anal. chem. 1989, 61, 1702−1708. 4 trimpin, s.; plasencia, m.; isailovic, d.; clemmer, d. e. anal. chem. 2007, 79, 7965−74. 5 huang, l. h.; gough, p. c.; defelippis, m. r. anal. chem. 2009, 81, 567−577.
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