KOD-Plus-Neo产品说明书
kod-plus-neo是基于一种ji端嗜热的海洋古生菌thermococcus kodakarensis的dna聚合酶。这种聚合酶由于其高效的3’-5’核酸外切酶活性（校对活性）。该产品含有一种du特的“延伸增强剂”，可抑制传统pcr产生的“平台效应”。因此，与先前版本的kod-plus（kod-201）相比，该试剂表现出更高的扩增效率和延伸能力。此外，这种酶对于pcr延伸步骤仅需要30秒/kb。这有利于长片段pcr。这种酶含有两种抑制聚合酶和3’-5’核酸外切酶活性的抗kod dna聚合酶抗体和，从而支持热启动pcr。
产品特点
ø 比普通taq dna聚合酶高80倍的pcr保真度。
ø 与传统pcr相比，“延伸增强剂”能够实现更高的扩增效率和延伸能力。
ø pcr延伸步骤只需要30秒/kb。
ø 两步循环条件可用于使用≥20 mer引物的扩增（退火温度，tm>63°c）。
产品组分
kod -plus- neo (1.0 u/μl)*
200 μl×1
10 x pcr buffer for kod -plus-neo
1 ml×1
25 mm mgso4
1 ml×1
2 mm dntps
1 ml×1
引物设计
ø 引物应为22-35个碱基，tm>63℃
ø 引物的最佳gc含量为45-60%。5’端和3’端的理想gc含量分别为60-70%和40-50%。
ø 长片段扩增的引物应为25-35个碱基，tm>65°c。
ø 不能使用含有肌苷的引物
ø 建议使用最近邻法计算引物的tm。本手册中的tm值是使用以下参数使用该方法计算的。na+浓度：50 mm 寡核苷酸浓度：0.5 µm
pcr产物的克隆
ø kod-plus-neo由于其3’-5’核酸外切酶活性。因此，pcr产物为平端产物，可以根据平端克隆方法进行克隆。
ø kod-plus-neo的pcr产物应在限制性内切酶处理之前进行纯化。kod dna聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性在pcr反应结束时仍然存在。
ø 克隆kod dna聚合酶产生的平端pcr产物推荐专用ta克隆试剂盒“target clone™ -plus- (code no. tak-201)”
实验步骤
1. 标准反应体系配置
反应物准备前，除酶溶液外，所有成分均应wan全解冻。
组分
体积
终浓度
10x buffer for kod -plus- neo
5 μl
1x
2 mm dntps
5 μl
0.2 mm each
25 mm mgso4
3 μl
1.5 mm
10 pmol/μl primer #1
0.75–1.5 μl
0.15–0.3 µm
10 pmol/μl primer #2
0.75–1.5 μl
0.15–0.3 µm
template dna
x μl
genomic dna ≤ 200 ng/50 μl
plasmid dna ≤ 50 ng/50 μl
cdna ≤ 200 ng（rna equiv.)/50 μl
pcr grade water
y μl
kod -plus- neo (1.0 u/μl)
1 μl
1.0 u/50 μl
总体积
50 μl
**不要使用其它试剂盒或其它公司的dntp
注意：
最佳引物浓度为0.3 µm。在长片段（≥10kb）的情况下，降低引物浓度（0.15µm）可能会产生更有效的扩增。
二甲基亚砜dmso（终浓度2-5%）的添加有利于扩增富含gc的靶标。在dmso存在的情况下，pcr保真度不会降低（参见步骤2，循环条件）。
cdna或基因组dna中的污染rna会通过螯合mg2+来抑制pcr反应。应使用<200 ng rna的模板dna进行pcr。
模板dna的质量应通过电泳检查。模板dna的长度和纯度会影响扩增结果。
含有尿嘧啶的模板不能用于扩增。
对于pcr反应，建议使用薄壁管。建议总反应体积为50 μl。
2. 循环条件
推荐≥20 mer的引物，tm>63°c的两步循环条件用于有效扩增。
两步循环：
如果引物的tm值超过63°c，建议采用两步循环。
注意：
对于使用低拷贝模板的扩增或长片段（>10kb）的扩增，更长的延伸时间（高达1 min/kb）或更高的mg2+浓度（高达2 mm终浓度）可以提高产率。
二甲基亚砜dmso（终浓度2-5%）的添加可能有利于扩增富含gc的片段。所用dmso的浓度应根据引物的tm来确定。
<25 mer or tm <68℃: 加2%
≥25 mer or tm ≥68℃: 加5%
如果扩增失败，可能需要3步循环
三步循环：
当引物的tm小于63℃时，应使用三步循环。
注意：
对于使用低拷贝模板的扩增或长片段（>10kb）的扩增，更长的延伸时间（高达1 min/kb）或更高的mg2+浓度（高达2 mm终浓度）可以提高产率。
二甲基亚砜dmso（终浓度2-5%）的添加可能有利于扩增富含gc的片段。
降落pcr：
如果在2步和3步循环条件下观察到非特异性扩增（在pcr产物电泳后观察到额外的条带），降落pcr则可以提高特异性。
注意：
对于使用低拷贝模板的扩增或长片段（>10kb）的扩增，更长的延伸时间（高达1 min/kb）或更高的mg2+浓度（高达2 mm终浓度）可以提高产率。
二甲基亚砜dmso（终浓度2-5%）的添加可能有利于扩增富含gc的片段。所用dmso的浓度应根据引物的tm来确定。
<25 mer or tm <68℃: 加2%
≥25 mer or tm ≥68℃: 加5%
应用实例
性能数据：
1. pcr保真度
用target克隆技术对从人基因组dna中扩增的人β-珠蛋白基因产物进行序列分析，测定突变频率。kod-plus-neo表现出ji好的保真度，突变频率与以前版本的酶（kod-plus-）相同。
2. 延伸能力
根据每种酶的推荐条件，通过几种pcr酶从人类基因组dna中扩增出各种大小的片段。kod-plus-neo成功扩增了17.5 kb的片段。
3. 低拷贝模板扩增
使用0.5 ng cdna模板扩增四个基因。模板由hela细胞的总rna合成。kod-plus-neo成功扩增了所有基因。
4. 延伸速度
不同的扩增时间从人类基因组dna（50ng）中扩增β-珠蛋白基因（3.6 kb）。kod-plus-neo可以用30秒/kb的延长时间扩增3.6 kb的靶标。
应用数据：
1. 各种蛋白激酶片段的扩增
利用hela细胞总rna合成的cdna扩增各种蛋白激酶开放阅读框。kod-plus-neo成功扩增了所有片段。
2. 长片段扩增
使用不同浓度的引物从人类基因组dna中扩增长片段。过多的引物会抑制扩增。因此，应使用约0.15 µm的较低引物浓度扩增长片段（>10 kb）。
常见问题及解决办法
问题
可能的原因
解决办法
无产物或低产量
循环条件不合适
使用三步循环，将退火温度逐渐降低至最大tm-5–10°c
将延伸时间延长至1分钟/kb
将循环次数增加2-5个循环
mg2+浓度低
将mg2+浓度增加至2 mm
目标序列gc含量高
加入2–5%的dmso
引物的质量和/或浓度问题
将引物浓度逐步降低至0.15 µm
使用新的引物
重新设计引物
模板dna的质量和/或浓度问题
检查模板dna的质量
增加模板dna的浓度
酶浓度低
将酶浓度提高至1.5–2.0 u/50 μl
弥散条带或杂带
循环条件不合适
将循环次数减少2-5个循环
从3步循环更改为2步循环
从2步循环更改为降落pcr
引物的质量问题
使用新的引物
重新设计引物
模板dna太多
减少模板dna的浓度
mg2+浓度太高
将mgso4逐步降低至1.0 mm
酶浓度太高
将酶浓度降至0.5–0.8 u/50 μl
ta克隆效率差
pcr产物具有平末端
使用专用ta克隆试剂盒target clone™-plus-(code no. tak-201)
参考文献
1) takagi m, nishioka m, kakihara h, kitabayashi m, inoue h, kawakami b, oka m, and imanaka t., appl environ microbiol., 63: 4504-10 (1997).
2) hashimoto h, nishioka m, fujiwara s, takagi m, imanaka t, inoue t and kai y, j mol biol., 306: 469-77 (2001).
3) mizuguchi h, nakatsuji m, fujiwara s, takagi m and imanaka t, j biochem., 126: 762-8 (1999).
4) fujii s, akiyama m, aoki k, sugaya y, higuchi k, hiraoka m, miki y, saitoh n, yoshiyama k, ihara k, seki m, ohtsubo e and maki h, j. mol. biol., 289: 835-850 (1999).
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货号
产品名称
规格
品牌
kod-401
kod -plus- neo
200 reactions
toyobo
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target clone™ -plus-
10 reactions
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25 reactions
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ligation high ver.2
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产品特点
ø 比普通taq dna聚合酶高80倍的pcr保真度。
ø 与传统pcr相比，“延伸增强剂”能够实现更高的扩增效率和延伸能力。
ø pcr延伸步骤只需要30秒/kb。
ø 两步循环条件可用于使用≥20 mer引物的扩增（退火温度，tm>63°c）。
产品组分
kod -plus- neo (1.0 u/μl)*
200 μl×1
10 x pcr buffer for kod -plus-neo
1 ml×1
25 mm mgso4
1 ml×1
2 mm dntps
1 ml×1
引物设计
ø 引物应为22-35个碱基，tm>63℃
ø 引物的最佳gc含量为45-60%。5’端和3’端的理想gc含量分别为60-70%和40-50%。
ø 长片段扩增的引物应为25-35个碱基，tm>65°c。
ø 不能使用含有肌苷的引物
ø 建议使用最近邻法计算引物的tm。本手册中的tm值是使用以下参数使用该方法计算的。na+浓度：50 mm 寡核苷酸浓度：0.5 µm
pcr产物的克隆
ø kod-plus-neo由于其3’-5’核酸外切酶活性。因此，pcr产物为平端产物，可以根据平端克隆方法进行克隆。
ø kod-plus-neo的pcr产物应在限制性内切酶处理之前进行纯化。kod dna聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性在pcr反应结束时仍然存在。
ø 克隆kod dna聚合酶产生的平端pcr产物推荐专用ta克隆试剂盒“target clone™ -plus- (code no. tak-201)”
实验步骤
1. 标准反应体系配置
反应物准备前，除酶溶液外，所有成分均应wan全解冻。
组分
体积
终浓度
10x buffer for kod -plus- neo
5 μl
1x
2 mm dntps
5 μl
0.2 mm each
25 mm mgso4
3 μl
1.5 mm
10 pmol/μl primer #1
0.75–1.5 μl
0.15–0.3 µm
10 pmol/μl primer #2
0.75–1.5 μl
0.15–0.3 µm
template dna
x μl
genomic dna ≤ 200 ng/50 μl
plasmid dna ≤ 50 ng/50 μl
cdna ≤ 200 ng（rna equiv.)/50 μl
pcr grade water
y μl
kod -plus- neo (1.0 u/μl)
1 μl
1.0 u/50 μl
总体积
50 μl
**不要使用其它试剂盒或其它公司的dntp
注意：
最佳引物浓度为0.3 µm。在长片段（≥10kb）的情况下，降低引物浓度（0.15µm）可能会产生更有效的扩增。
二甲基亚砜dmso（终浓度2-5%）的添加有利于扩增富含gc的靶标。在dmso存在的情况下，pcr保真度不会降低（参见步骤2，循环条件）。
cdna或基因组dna中的污染rna会通过螯合mg2+来抑制pcr反应。应使用<200 ng rna的模板dna进行pcr。
模板dna的质量应通过电泳检查。模板dna的长度和纯度会影响扩增结果。
含有尿嘧啶的模板不能用于扩增。
对于pcr反应，建议使用薄壁管。建议总反应体积为50 μl。
2. 循环条件
推荐≥20 mer的引物，tm>63°c的两步循环条件用于有效扩增。
两步循环：
如果引物的tm值超过63°c，建议采用两步循环。
注意：
对于使用低拷贝模板的扩增或长片段（>10kb）的扩增，更长的延伸时间（高达1 min/kb）或更高的mg2+浓度（高达2 mm终浓度）可以提高产率。
二甲基亚砜dmso（终浓度2-5%）的添加可能有利于扩增富含gc的片段。所用dmso的浓度应根据引物的tm来确定。
<25 mer or tm <68℃: 加2%
≥25 mer or tm ≥68℃: 加5%
如果扩增失败，可能需要3步循环
三步循环：
当引物的tm小于63℃时，应使用三步循环。
注意：
对于使用低拷贝模板的扩增或长片段（>10kb）的扩增，更长的延伸时间（高达1 min/kb）或更高的mg2+浓度（高达2 mm终浓度）可以提高产率。
二甲基亚砜dmso（终浓度2-5%）的添加可能有利于扩增富含gc的片段。
降落pcr：
如果在2步和3步循环条件下观察到非特异性扩增（在pcr产物电泳后观察到额外的条带），降落pcr则可以提高特异性。
注意：
对于使用低拷贝模板的扩增或长片段（>10kb）的扩增，更长的延伸时间（高达1 min/kb）或更高的mg2+浓度（高达2 mm终浓度）可以提高产率。
二甲基亚砜dmso（终浓度2-5%）的添加可能有利于扩增富含gc的片段。所用dmso的浓度应根据引物的tm来确定。
<25 mer or tm <68℃: 加2%
≥25 mer or tm ≥68℃: 加5%
应用实例
性能数据：
1. pcr保真度
用target克隆技术对从人基因组dna中扩增的人β-珠蛋白基因产物进行序列分析，测定突变频率。kod-plus-neo表现出ji好的保真度，突变频率与以前版本的酶（kod-plus-）相同。
2. 延伸能力
根据每种酶的推荐条件，通过几种pcr酶从人类基因组dna中扩增出各种大小的片段。kod-plus-neo成功扩增了17.5 kb的片段。
3. 低拷贝模板扩增
使用0.5 ng cdna模板扩增四个基因。模板由hela细胞的总rna合成。kod-plus-neo成功扩增了所有基因。
4. 延伸速度
不同的扩增时间从人类基因组dna（50ng）中扩增β-珠蛋白基因（3.6 kb）。kod-plus-neo可以用30秒/kb的延长时间扩增3.6 kb的靶标。
应用数据：
1. 各种蛋白激酶片段的扩增
利用hela细胞总rna合成的cdna扩增各种蛋白激酶开放阅读框。kod-plus-neo成功扩增了所有片段。
2. 长片段扩增
使用不同浓度的引物从人类基因组dna中扩增长片段。过多的引物会抑制扩增。因此，应使用约0.15 µm的较低引物浓度扩增长片段（>10 kb）。
常见问题及解决办法
问题
可能的原因
解决办法
无产物或低产量
循环条件不合适
使用三步循环，将退火温度逐渐降低至最大tm-5–10°c
将延伸时间延长至1分钟/kb
将循环次数增加2-5个循环
mg2+浓度低
将mg2+浓度增加至2 mm
目标序列gc含量高
加入2–5%的dmso
引物的质量和/或浓度问题
将引物浓度逐步降低至0.15 µm
使用新的引物
重新设计引物
模板dna的质量和/或浓度问题
检查模板dna的质量
增加模板dna的浓度
酶浓度低
将酶浓度提高至1.5–2.0 u/50 μl
弥散条带或杂带
循环条件不合适
将循环次数减少2-5个循环
从3步循环更改为2步循环
从2步循环更改为降落pcr
引物的质量问题
使用新的引物
重新设计引物
模板dna太多
减少模板dna的浓度
mg2+浓度太高
将mgso4逐步降低至1.0 mm
酶浓度太高
将酶浓度降至0.5–0.8 u/50 μl
ta克隆效率差
pcr产物具有平末端
使用专用ta克隆试剂盒target clone™-plus-(code no. tak-201)
参考文献
1) takagi m, nishioka m, kakihara h, kitabayashi m, inoue h, kawakami b, oka m, and imanaka t., appl environ microbiol., 63: 4504-10 (1997).
2) hashimoto h, nishioka m, fujiwara s, takagi m, imanaka t, inoue t and kai y, j mol biol., 306: 469-77 (2001).
3) mizuguchi h, nakatsuji m, fujiwara s, takagi m and imanaka t, j biochem., 126: 762-8 (1999).
4) fujii s, akiyama m, aoki k, sugaya y, higuchi k, hiraoka m, miki y, saitoh n, yoshiyama k, ihara k, seki m, ohtsubo e and maki h, j. mol. biol., 289: 835-850 (1999).
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品牌
kod-401
kod -plus- neo
200 reactions
toyobo
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