内质网应激-ATF-6激活在循环拉伸诱导的成肌细胞自噬和凋亡中的双重作用
安氏ⅱ类错牙合是口腔正畸学中的一种临床疾病。功能矫治器是一种本身不产生任何机械力，通过改变颌面部的肌肉环境，促进颌发育及颅面骨骼生长的一类矫正器。机械力信号被传递到细胞中并促进骨骼肌重塑。因此，阐明拉伸诱导的细胞凋亡的潜在机制对于进一步优化临床治疗非常重要。
细胞凋亡的机制是多种多样的，其中比较常见的有三种机制，分别为内质网应激（ers）、线粒体通路和死受体通路。内质网蛋白质折叠和修饰是一个高度调控的过程。然而，各种内源性和外源性应激可以破坏细胞器中的蛋白质稳态，导致内质网应激。越来越多的证据表明，内质网应激也会导致自噬。已经发现，有助于自噬发生的ire1-jnk、perk-eif2α和akt-tsc-mtor信号通路在ers条件下被激活。
未折叠蛋白反应（upr）是一种高度保守的适应性机制，有三个分支协调对未折叠或错误折叠蛋白质的有害累积的反应。它们包括：肌醇需求酶1α（ire1α）、蛋白激酶r样内质网激酶（perk）和激活转录因子6（aft6）。chop，caspase-12和jnk是三个与er相关的信号通路。研究表明，内质网应激在骨骼肌重塑中拉伸诱导的细胞凋亡中起着至关重要的作用。激活的atf-6进入细胞核以促进upr相关蛋白的表达。这增加了er的生物合成能力，从而使细胞在ers下存活。当ers被触发和延长时，atf-6还可以激活chop等下游蛋白，从而诱导细胞凋亡。然而，atf-6信号通路在骨骼肌重塑中的作用尚不清楚。
bcl-2家族蛋白对于调节各种细胞的凋亡至关重要。据报道，bcl-2通过与beclin1相互作用来调节自噬，beclin1被称为自噬的标记蛋白。bcl-2 对自噬和凋亡的信号通路存在交叉调控。然而，目前尚不清楚atf-6通路是否参与拉伸诱导的成肌细胞的凋亡和自噬。
为了解决这个问题，青岛大学附属医院口腔正畸科、青岛市立医院口腔科的研究团队曾研究了拉伸诱导的成肌细胞凋亡和自噬的潜在分子机制，这有助于阐明机械拉伸产生的ers条件下自噬与细胞凋亡之间的关系。相关内容发表在 apoptosis 期刊题为“dual role of endoplasmic reticulum stress-atf-6 activation in autophagy and apoptosis induced by cyclic stretch in myoblast”。
首先，为了确认机械拉伸对细胞活力的影响，将成肌细胞暴露于15% 伸长率的循环机械拉伸下（每循环提供6 秒的机械拉伸）分别持续0、6、12和24小时，结果表明，机械拉伸显著降低了细胞活力，呈时间依赖性抑制了成肌细胞的生长。接着采用tunel染色和av/pi流式细胞术分析了机械拉伸的促凋亡作用，数据表明，成肌细胞的凋亡率随着负荷时间逐渐升高，并在24 小时时达到最大值。基于这些结果，得出结论，机械拉伸诱导成肌细胞凋亡是时间依赖性的。
为探究ers对拉伸诱导的成肌细胞凋亡的作用，采用qrt-pcr和蛋白质印迹法检测ers标志基因（grp78、atf-6、chop和caspase-12）的表达。结果表明，ers相关基因的mrna水平随着拉伸时间的增加而上调，并在24小时时达到峰值（图1 a）。用机械拉伸处理24 小时后，er相关基因蛋白的表达水平与mrna表达呈相似升高（图1 b）。这说明，循环拉伸激活ers介导的细胞凋亡。
图1 循环拉伸激活ers介导的细胞凋亡。（a）通过实时pcr检测grp78，atf-6，chop和caspase-12的表达。（b）具有代表性的蛋白质印迹结果显示拉伸对grp78，atf-6，chop和caspase-12 蛋白质水平的影响。
接下来，为了阐明自噬在机械应力下牙颌面肌肉重塑中的作用，实验使用蛋白质印迹检测自噬相关蛋白（lc3-ii、p62、beclin1）的表达。结果表明，beclin1和lc3-ii在拉伸组中的表达呈时间依赖性显著升高，而p62随着拉伸时间的延长而降低。而且循环拉伸24 小时后，成肌细胞中双膜自噬体的数量增加。lc3-ii积累表明自噬体形成增加或自噬体-溶酶体融合受损。这些结果表明，机械拉伸处理后成肌细胞发生细胞自噬。
为了进一步证实ers在拉伸诱导的细胞凋亡和自噬中的作用，在成肌细胞中使用erss抑制剂4-pba。ers被4-pba预处理抑制（图2 a）。4-pba成功降低了beclin1的蛋白质水平，拉伸诱导的成肌细胞中的lc3ii降低，但没有降低p62（图2 a）。如图2 b所显示，抑制ers缓解拉伸诱导的成肌细胞凋亡。此外，循环拉伸增加了红色和黄色点状体的百分比，而4-pba处理抑制了此效果。这表明4-pba处理显著缓解了拉伸诱导的自噬（图2 c）。这些结果表明，ers参与拉伸诱导的细胞凋亡和自噬。
图2 ers对拉伸诱导的成肌细胞凋亡和自噬的作用。（a）在有或没有4-pba时机械拉伸下grp78，atf-6，chop，bcl-2，lc3和beclin1表达水平的蛋白质印迹分析。 （b）进行tunel染色以评估细胞凋亡水平。（c）在成肌细胞中进行免疫荧光测定以确定自噬水平，并显示lc3斑点的定量分析。
最后，为了进一步阐明自噬的作用及其与ers和细胞凋亡的关系，使用3-ma抑制成肌细胞的自噬。与单独机械拉伸组相比，3-ma和机械拉伸的联合处理显著增强了chop的表达。同时，3-ma处理也增加了凋亡细胞的数量。然而，3-ma对ers标志物（grp78和atf-6）没有明显影响。此外，3-ma显著增加了拉伸诱导的成肌细胞凋亡。这些结果表明，自噬参与拉伸诱导的成肌细胞凋亡，但可能对ers没有明显影响。从图2 a表明，4-pba预处理显著改善了成肌细胞中lc3ii/i和细胞凋亡相关蛋白的表达。然而，抑制自噬对ers相关蛋白grp78和atf-6的表达没有明显影响。这意味着，循环拉伸暴露下自噬不是ers 的原因。
上述结果表明，atf-6可能在拉伸诱导的自噬和细胞凋亡中起重要作用。因此，为进一步阐明其在机械拉伸诱导的成肌细胞凋亡和自噬中的作用，创建了atf-6沉默的成肌细胞，在循环拉伸之前用atf-6 sirna3转染成肌细胞（图3 a）。数据显示，机械拉伸对成肌细胞的凋亡作用减弱（图3 c）。敲低atf-6可以显著降低chop的水平，增加bcl-2的水平，cleaved caspase-12 表达无变化。这意味着，atf-6通过循环拉伸处理的成肌细胞中的bcl-2和chop通路在ers介导的细胞凋亡中发挥作用。这些结果表明，atf-6通路在调节拉伸诱导的成肌细胞凋亡和自噬过程中起着至关重要的作用。
图3 atf-6在成肌细胞中拉伸诱导的自噬和凋亡中起重要的作用。
（a）蛋白质印迹和实时pcr结果证实，在sirna3转染的成肌细胞中，atf-6水平被敲低最多。（b）蛋白质印迹结果表明，转染sirna或不转染sirna后，拉伸成肌细胞中chop、 cleaved caspase-12、bcl-2、lc3、beclin1和p62的表达水平（c）通过膜联蛋白v-fitc染色检测细胞凋亡。（d）用mrfp-gfp-lc3腺病毒转染24小时，转染sirna或不转染sirna后，免疫荧光测定成肌细胞中的自噬。
综上所述，这项研究表明，成肌细胞在体外经历循环拉伸，并通过凋亡和自噬方式对机械拉伸做出反应，这与atf-6介导的ers通路密切相关。在机械拉伸下，自噬被诱导。这削弱了成肌细胞凋亡的过程，这已被确定为防止细胞死亡的作用。该研究解释了atf-6通路在拉伸诱导的细胞凋亡和自噬的分子机制中的作用，确保了对功能性器具影响成肌细胞的机制有充分的了解。然而，在拉伸刺激下，内质网应激诱导的成肌细胞凋亡和自噬之间发生的串扰需要进一步阐明。因此，未来的研究可以阐明ers，细胞凋亡和自噬参与拉伸成肌细胞的确切相互作用机制。
参考文献：zhang q, liu g, liu r, liu j, zeng x, ren d, yan x, yuan x. dual role of endoplasmic reticulum stress-atf-6 activation in autophagy and apoptosis induced by cyclic stretch in myoblast. apoptosis. 2023 jun;28(5-6):796-809. doi: 10.1007/s10495-023-01825-5. epub 2023 mar 7. erratum in: apoptosis. 2023 jul 13;: pmid: 36881290.
原文链接：pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36881290/
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未折叠蛋白反应（upr）是一种高度保守的适应性机制，有三个分支协调对未折叠或错误折叠蛋白质的有害累积的反应。它们包括：肌醇需求酶1α（ire1α）、蛋白激酶r样内质网激酶（perk）和激活转录因子6（aft6）。chop，caspase-12和jnk是三个与er相关的信号通路。研究表明，内质网应激在骨骼肌重塑中拉伸诱导的细胞凋亡中起着至关重要的作用。激活的atf-6进入细胞核以促进upr相关蛋白的表达。这增加了er的生物合成能力，从而使细胞在ers下存活。当ers被触发和延长时，atf-6还可以激活chop等下游蛋白，从而诱导细胞凋亡。然而，atf-6信号通路在骨骼肌重塑中的作用尚不清楚。
bcl-2家族蛋白对于调节各种细胞的凋亡至关重要。据报道，bcl-2通过与beclin1相互作用来调节自噬，beclin1被称为自噬的标记蛋白。bcl-2 对自噬和凋亡的信号通路存在交叉调控。然而，目前尚不清楚atf-6通路是否参与拉伸诱导的成肌细胞的凋亡和自噬。
为了解决这个问题，青岛大学附属医院口腔正畸科、青岛市立医院口腔科的研究团队曾研究了拉伸诱导的成肌细胞凋亡和自噬的潜在分子机制，这有助于阐明机械拉伸产生的ers条件下自噬与细胞凋亡之间的关系。相关内容发表在 apoptosis 期刊题为“dual role of endoplasmic reticulum stress-atf-6 activation in autophagy and apoptosis induced by cyclic stretch in myoblast”。
首先，为了确认机械拉伸对细胞活力的影响，将成肌细胞暴露于15% 伸长率的循环机械拉伸下（每循环提供6 秒的机械拉伸）分别持续0、6、12和24小时，结果表明，机械拉伸显著降低了细胞活力，呈时间依赖性抑制了成肌细胞的生长。接着采用tunel染色和av/pi流式细胞术分析了机械拉伸的促凋亡作用，数据表明，成肌细胞的凋亡率随着负荷时间逐渐升高，并在24 小时时达到最大值。基于这些结果，得出结论，机械拉伸诱导成肌细胞凋亡是时间依赖性的。
为探究ers对拉伸诱导的成肌细胞凋亡的作用，采用qrt-pcr和蛋白质印迹法检测ers标志基因（grp78、atf-6、chop和caspase-12）的表达。结果表明，ers相关基因的mrna水平随着拉伸时间的增加而上调，并在24小时时达到峰值（图1 a）。用机械拉伸处理24 小时后，er相关基因蛋白的表达水平与mrna表达呈相似升高（图1 b）。这说明，循环拉伸激活ers介导的细胞凋亡。
图1 循环拉伸激活ers介导的细胞凋亡。（a）通过实时pcr检测grp78，atf-6，chop和caspase-12的表达。（b）具有代表性的蛋白质印迹结果显示拉伸对grp78，atf-6，chop和caspase-12 蛋白质水平的影响。
接下来，为了阐明自噬在机械应力下牙颌面肌肉重塑中的作用，实验使用蛋白质印迹检测自噬相关蛋白（lc3-ii、p62、beclin1）的表达。结果表明，beclin1和lc3-ii在拉伸组中的表达呈时间依赖性显著升高，而p62随着拉伸时间的延长而降低。而且循环拉伸24 小时后，成肌细胞中双膜自噬体的数量增加。lc3-ii积累表明自噬体形成增加或自噬体-溶酶体融合受损。这些结果表明，机械拉伸处理后成肌细胞发生细胞自噬。
为了进一步证实ers在拉伸诱导的细胞凋亡和自噬中的作用，在成肌细胞中使用erss抑制剂4-pba。ers被4-pba预处理抑制（图2 a）。4-pba成功降低了beclin1的蛋白质水平，拉伸诱导的成肌细胞中的lc3ii降低，但没有降低p62（图2 a）。如图2 b所显示，抑制ers缓解拉伸诱导的成肌细胞凋亡。此外，循环拉伸增加了红色和黄色点状体的百分比，而4-pba处理抑制了此效果。这表明4-pba处理显著缓解了拉伸诱导的自噬（图2 c）。这些结果表明，ers参与拉伸诱导的细胞凋亡和自噬。
图2 ers对拉伸诱导的成肌细胞凋亡和自噬的作用。（a）在有或没有4-pba时机械拉伸下grp78，atf-6，chop，bcl-2，lc3和beclin1表达水平的蛋白质印迹分析。 （b）进行tunel染色以评估细胞凋亡水平。（c）在成肌细胞中进行免疫荧光测定以确定自噬水平，并显示lc3斑点的定量分析。
最后，为了进一步阐明自噬的作用及其与ers和细胞凋亡的关系，使用3-ma抑制成肌细胞的自噬。与单独机械拉伸组相比，3-ma和机械拉伸的联合处理显著增强了chop的表达。同时，3-ma处理也增加了凋亡细胞的数量。然而，3-ma对ers标志物（grp78和atf-6）没有明显影响。此外，3-ma显著增加了拉伸诱导的成肌细胞凋亡。这些结果表明，自噬参与拉伸诱导的成肌细胞凋亡，但可能对ers没有明显影响。从图2 a表明，4-pba预处理显著改善了成肌细胞中lc3ii/i和细胞凋亡相关蛋白的表达。然而，抑制自噬对ers相关蛋白grp78和atf-6的表达没有明显影响。这意味着，循环拉伸暴露下自噬不是ers 的原因。
上述结果表明，atf-6可能在拉伸诱导的自噬和细胞凋亡中起重要作用。因此，为进一步阐明其在机械拉伸诱导的成肌细胞凋亡和自噬中的作用，创建了atf-6沉默的成肌细胞，在循环拉伸之前用atf-6 sirna3转染成肌细胞（图3 a）。数据显示，机械拉伸对成肌细胞的凋亡作用减弱（图3 c）。敲低atf-6可以显著降低chop的水平，增加bcl-2的水平，cleaved caspase-12 表达无变化。这意味着，atf-6通过循环拉伸处理的成肌细胞中的bcl-2和chop通路在ers介导的细胞凋亡中发挥作用。这些结果表明，atf-6通路在调节拉伸诱导的成肌细胞凋亡和自噬过程中起着至关重要的作用。
图3 atf-6在成肌细胞中拉伸诱导的自噬和凋亡中起重要的作用。
（a）蛋白质印迹和实时pcr结果证实，在sirna3转染的成肌细胞中，atf-6水平被敲低最多。（b）蛋白质印迹结果表明，转染sirna或不转染sirna后，拉伸成肌细胞中chop、 cleaved caspase-12、bcl-2、lc3、beclin1和p62的表达水平（c）通过膜联蛋白v-fitc染色检测细胞凋亡。（d）用mrfp-gfp-lc3腺病毒转染24小时，转染sirna或不转染sirna后，免疫荧光测定成肌细胞中的自噬。
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参考文献：zhang q, liu g, liu r, liu j, zeng x, ren d, yan x, yuan x. dual role of endoplasmic reticulum stress-atf-6 activation in autophagy and apoptosis induced by cyclic stretch in myoblast. apoptosis. 2023 jun;28(5-6):796-809. doi: 10.1007/s10495-023-01825-5. epub 2023 mar 7. erratum in: apoptosis. 2023 jul 13;: pmid: 36881290.
原文链接：pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36881290/
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