PCR反应假阴性及假阳性问题可能原因及解决方法

一、假阴性(无扩增产物)
现象:正对照有条带,样品无条带
可能原因:
· 模板:含有 taq 酶抑制剂、杂蛋白,模板上样量低或模板降解
· 引物:引物降解,引物设计不合理
· 试剂:酶失活,buffer 不合适
· 反应条件:退火温度高,延伸时间短
解决方法:
· 纯化模板并重新提取,并检测模板是否含有抑制剂
· 重新设计引物并低温保存
· 优化 buffer,摸索镁离子浓度或适当加入 dmso(小于 0.3%)
· 提高退火温度,增加延伸时间(反应条件参照试剂盒说明书)
二、假阳性
现象:空白对照出现条带
可能原因:
· 引物设计不适,与目的序列具有同源性
· 试剂污染:水、移液枪等被核酸污染
· 样品间出现交叉污染
解决方法:
· 实验仪器高压灭菌
· 实验试剂(酶除外)高压灭菌,离心管枪头一次性使用
· 规范实验操作
· 假阳性可通过巢式 pcr 解决,或者使用特异性较高的试剂盒扩增
关键词:移液枪

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