RNA抽提的窍门与提高得率分享
rna抽提的窍门
1：快速阻止 rnase 活性 – 样品收集后快速冷冻，裂解时快速操作灭活 rnase。
2：选择合适的抽提方法 – 高核酶含量的组织，脂肪组织最好用含苯ben酚的方法。
3：预判质量要求 – northern，cdna 文库构建对完整性要求高，rt-pcr, rpa (ribonuclease protection assay) 对完整性要求不是很高。rt-pcr 对纯度 (酶抑制物残留) 要求很高。
4：彻di底匀浆是提高得率和降低降解的关键。
5：检查 rna 的完整性 – 电泳检测，28s:18s =2:1 是完整的标志，1:1 对大部分实验也是可以接受的。
6：去除 dna – 用于 rt-pcr, array analysis 最好用 dnase i 去除 dna。
7：降低外源酶的污染 – 不能从外面又导入酶。
8：低浓度的核酸浓缩时，要加入助沉淀试剂。但要防止助沉淀剂含酶及 dna 污染。
9：彻di底溶解 rna，必要时可以 65c 加热 5 分钟。
10：合适的保存方法 – 短时间可以 –20c 保存，长期请保存于 –80c。
提高rna得率
首先要意识到不同得样品其 rna 含量差别很大。高丰度 (2-4ug/mg) 的如肝脏，胰腺，心脏，中丰度 (0.05-2ug/mg) 的如脑，胚胎，肾脏，肺，胸腺，卵巢，低丰度 (<0.05ug/mg) 的如膀胱，骨，脂肪。
1：裂解细胞使 rna 释放出来 – rna 如果不被释放出来，得率是会降低的。电动匀浆比其它匀浆方法效果更好，但也可能需要结合其它得方法，如液氮捣碎，酶消化 (lysozyme/lyticase)
2：抽提方法的优化。基于苯ben酚的方法的最大问题是分层不彻di底和部分 rna 的丢失(不能全部将上清取出)。分层不彻di底是因为核酸和蛋白质含量高，可以用增加裂解液使用量或者降低样品量解决。脂肪组织要增加一步氯仿抽提。rna 的丢失可以用反抽方法或者去除有机层后再离心的方法降低。基于柱离心式方法的最大问题是样品过量。
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5：检查 rna 的完整性 – 电泳检测，28s:18s =2:1 是完整的标志，1:1 对大部分实验也是可以接受的。
6：去除 dna – 用于 rt-pcr, array analysis 最好用 dnase i 去除 dna。
7：降低外源酶的污染 – 不能从外面又导入酶。
8：低浓度的核酸浓缩时，要加入助沉淀试剂。但要防止助沉淀剂含酶及 dna 污染。
9：彻di底溶解 rna，必要时可以 65c 加热 5 分钟。
10：合适的保存方法 – 短时间可以 –20c 保存，长期请保存于 –80c。
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2：抽提方法的优化。基于苯ben酚的方法的最大问题是分层不彻di底和部分 rna 的丢失(不能全部将上清取出)。分层不彻di底是因为核酸和蛋白质含量高，可以用增加裂解液使用量或者降低样品量解决。脂肪组织要增加一步氯仿抽提。rna 的丢失可以用反抽方法或者去除有机层后再离心的方法降低。基于柱离心式方法的最大问题是样品过量。
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