PCR试剂盒灵敏度与方法验证概说
pcr方法已广泛用于科研，在工业中也有不断扩大应用的趋势，它包括检测一些病原体、检测支原体污染、检测细菌污染以及检测残留宿主dna等。
pcr在工业中的应用主要存在一个方法验证的问题，尤其是灵敏度的验证。灵敏度不够，就会发生漏检。另外，pcr所直接面对的样本是dna，而非病原菌或dna，因此还需要做dna抽提，这也是要注意的。
下面以支原体pcr检测为例，略说说灵敏度的验证。
药典规定，生物药厂的主细胞库、工作细胞库、生产终末细胞、检定细胞、病毒种子批和病毒收获液、细胞培养相关材料如培养基、*、临床治疗用干细胞和免疫细胞等，都必须不含支原体。
因此，如能采用pcr检测支原体并替代药典方法，还是能节省很多时间和精力。但pcr方法的验证需要较为全面。灵敏度验证是一个重要方面。灵敏度不够，就会发生漏检。《欧洲药典》第2.6.7章（ep 2.6.7）和《日本药典》第17版第g3章（jp g3），都规定，对于核酸扩增法（如pcr）检测支原体，如替代传统的培养法，都要求检测限达到10 cfu/ml。
具体验证可使用10cfu的支原体灵敏度标准品，它一般为冻干粉形式，需要用待测样本的样本基质（需保证里面不含支原体）来复溶，再进行dna抽提以及pcr检测。如检测的电泳有条带，或者qpcr检测后的ct值小于40，即表明检测成功。
因此，在选用支原体pcr法检测来替代药典方法时，需要考虑如下两个方面：
第yi步是要使用符合欧洲药典要求，经过全面验证的支原体检测试剂盒，第二部是自我验证，即确认所用的样本基质对于该试剂盒方法是合适的，并且操作过程是正确的。小规模的室内验证通常需要采用三个不同批次的试剂盒，然后加入10cfu的标准品，做复孔（通常是8个复孔），并且至少选择3个支原体物种进行验证。
有的支原体标准品厂家会提供cfu与基因拷贝数的比值，以方便二者的换算。因为10cfu只能确定pcr能够达到的检测限在10cfu以下，但无法具体确定灵敏度的数值。带dna拷贝数标定的基因组dna标准品则可进一步确定检测限的数值。
总之，pcr方法很有用，但需要避免假阴性，验证时应使用阳性对照、阴性对照、无模板对照和内控对照，以保证pcr反应正常，以及支原体少量存在时确实能检出来，支原体不存在时也确保是结果阴性，从而使得pcr方法在工业应用时能确保终结果的可靠。
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