MC3T3细胞相关操作
mc3t3细胞相关操作：
培养条件：
每两天换液一次
无菌恒温培养箱
37℃
5%co2
ph值7.2~7.4
*培养基成分:不含酚红α-mem、10%fbs,0.1mg/mll-*盐,and1%双抗（100uml−1*and100μgml−1*）,（20mmhepes?）
诱导成骨细胞分化：上述+50μg/ml抗坏血酸and10（5？）mmβ-磷酸甘油
细胞复苏
1.37°c水浴预热培养基（αmem+10%fbs）；
2.从液氮中取出细胞迅速放入37°c水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）；
3.在超净台中加入5ml培养基重悬细胞，1000rpm离心5min；
4.弃上清，加入5ml培养基重悬细胞后转入t25培养瓶中，轻轻晃匀；
5.置于37°c，5%co2培养箱中培养（培养瓶盖没有透气孔的话，瓶盖不要拧太紧）；
6.第二天，用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养。
细胞传代
1.当细胞融合度达到90%以上时，给细胞传代；
2.37°c水浴预热培养基（αmem+10%fbs）；
3.在超净台中，弃培养基，加入2-5mlpbs清洗细胞后，再加入1ml*消化细胞；
4.显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，加入5ml培养基（αmem+10%fbs）终止消化；
5.用移液器轻轻吹下瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹散；
6.将细胞移入离心管中，1000rpm离心5min；
7.弃上清，加入15-20ml的培养基（含血清）重悬细胞后转入t75培养瓶中或按适当比例传到t25瓶中（确保细胞贴壁后融合度在25-50%之间），细胞密度在1×104cells/cm2（2.5×105cells/t-25瓶），混匀细胞悬液，确保细胞均匀分布；
8.将培养瓶置于37°c，5%co2的无菌培养箱中培养。
骨髓间充质干细胞培养方法：
培养基：d-mem（低糖）（450ml）、10%fbs（50ml）、10mg/ml*（250ul）、0.1mg/mll-*盐
无菌恒温培养箱
37℃
5%co2
1、接种细胞后，每48h更换一次培养基。每周传代两次，传代时机选在分裂率为1：3或1：4时进行。通常试验选用3-8传代细胞。
2、细胞鉴定：
①第四传代，去除培养基，加入3mlof0.25%（重量/体积）*/0.02%（重量/体积）edta，室温下消化3min。冲洗细胞，加入1ml冷pbs（4—8℃），4℃下300g离心8min，离心两次。每个离心管中用100ul冷pbs悬浮1×106个细胞，使用抗鼠fitc标记sca-1,cd11bandcd45抗体染色，或者是pe标记cd29,cd31,cd34,cd44,cd86,cd105,ia抗体染色，留一管用作对照。
②细胞在暗环境下于4℃环境中染色30min
③冲洗细胞，加入1ml冷pbs（4—8℃），4℃下300g离心8min，离心两次。
④为了评估细胞生活状况，在300ul冷pbs中加入pi（0.6µg每百万细胞），加入细胞中，室温暗环境下孵育15min。
⑤采用流式细胞仪分析细胞。使用fl1、fl2发射通道。每个样本收集201,000个事件。
3、成骨细胞分化：
①第四传代，去除培养基，加入3mlof0.25%（重量/体积）*/0.02%（重量/体积）edta，室温下消化3min。
②24孔每孔接种1×104个细胞。培养基为α-mem，10%（体积分数）fbs,10−7m*,10mmβ-*and50µm2-磷酸抗坏血酸盐，每孔培养基500ul。
③每周更换两次培养基，培养2-4周，该期间细胞不传代
④14天后，使用alkalinephosphatasekit在6孔板上测定alp活性。
⑤再培养14d。
⑥vonkossa染色评估矿化情况，每孔将培养基替换为多聚甲醛，处理30min
⑦每孔用3ml蒸馏水冲洗3min，共冲洗3遍
⑧每孔以300µl，5%（wt/vol）*溶液染色，在光下孵育30min
⑨每孔用3ml蒸馏水冲洗3min，共冲洗3遍
10吸净水，每孔加入300µl，5%（wt/vol）*溶液，处理5min
11每孔用3ml蒸馏水冲洗3min，共冲洗3
艾泽信：
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培养条件：
每两天换液一次
无菌恒温培养箱
37℃
5%co2
ph值7.2~7.4
*培养基成分:不含酚红α-mem、10%fbs,0.1mg/mll-*盐,and1%双抗（100uml−1*and100μgml−1*）,（20mmhepes?）
诱导成骨细胞分化：上述+50μg/ml抗坏血酸and10（5？）mmβ-磷酸甘油
细胞复苏
1.37°c水浴预热培养基（αmem+10%fbs）；
2.从液氮中取出细胞迅速放入37°c水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）；
3.在超净台中加入5ml培养基重悬细胞，1000rpm离心5min；
4.弃上清，加入5ml培养基重悬细胞后转入t25培养瓶中，轻轻晃匀；
5.置于37°c，5%co2培养箱中培养（培养瓶盖没有透气孔的话，瓶盖不要拧太紧）；
6.第二天，用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养。
细胞传代
1.当细胞融合度达到90%以上时，给细胞传代；
2.37°c水浴预热培养基（αmem+10%fbs）；
3.在超净台中，弃培养基，加入2-5mlpbs清洗细胞后，再加入1ml*消化细胞；
4.显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，加入5ml培养基（αmem+10%fbs）终止消化；
5.用移液器轻轻吹下瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹散；
6.将细胞移入离心管中，1000rpm离心5min；
7.弃上清，加入15-20ml的培养基（含血清）重悬细胞后转入t75培养瓶中或按适当比例传到t25瓶中（确保细胞贴壁后融合度在25-50%之间），细胞密度在1×104cells/cm2（2.5×105cells/t-25瓶），混匀细胞悬液，确保细胞均匀分布；
8.将培养瓶置于37°c，5%co2的无菌培养箱中培养。
骨髓间充质干细胞培养方法：
培养基：d-mem（低糖）（450ml）、10%fbs（50ml）、10mg/ml*（250ul）、0.1mg/mll-*盐
无菌恒温培养箱
37℃
5%co2
1、接种细胞后，每48h更换一次培养基。每周传代两次，传代时机选在分裂率为1：3或1：4时进行。通常试验选用3-8传代细胞。
2、细胞鉴定：
①第四传代，去除培养基，加入3mlof0.25%（重量/体积）*/0.02%（重量/体积）edta，室温下消化3min。冲洗细胞，加入1ml冷pbs（4—8℃），4℃下300g离心8min，离心两次。每个离心管中用100ul冷pbs悬浮1×106个细胞，使用抗鼠fitc标记sca-1,cd11bandcd45抗体染色，或者是pe标记cd29,cd31,cd34,cd44,cd86,cd105,ia抗体染色，留一管用作对照。
②细胞在暗环境下于4℃环境中染色30min
③冲洗细胞，加入1ml冷pbs（4—8℃），4℃下300g离心8min，离心两次。
④为了评估细胞生活状况，在300ul冷pbs中加入pi（0.6µg每百万细胞），加入细胞中，室温暗环境下孵育15min。
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⑧每孔以300µl，5%（wt/vol）*溶液染色，在光下孵育30min
⑨每孔用3ml蒸馏水冲洗3min，共冲洗3遍
10吸净水，每孔加入300µl，5%（wt/vol）*溶液，处理5min
11每孔用3ml蒸馏水冲洗3min，共冲洗3
艾泽信：
不锈钢抽芯铆钉锈蚀是什么原因造成？
球磨机用什么转速好？
工业废气常用的处理方法
全自动切管机设备的维护事项
外墙聚氨酯保温板销售价格/报价 产品报价
MC3T3细胞相关操作
多功能样品浓缩氮吹仪的设计创新和产品特点介绍
选择平面磨床厂家可以以这种企业作为参考
实验室如何正确保存色谱试剂？
建材院*JF-6型智能全自动触摸屏数显氧指数测定仪
用鼓风干燥箱测定饲料中的水分
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金相显微镜常见问题解决方法
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