干细胞转染及基因编辑，一篇讲透！
目前有多种方法可以将基因导入真核细胞内，一般可分为病毒类载体技术和非病毒类载体技术，后者具有低毒性和低免疫反应的特点，且不受细胞或种属特异机制和导入片段大小等限制的优势。其中，电穿孔法以其较高的转染率而备受关注。电穿孔法是应用短暂的高压电流脉冲诱导活细胞产生跨膜电位，由于外加电场强度大于细胞膜穿孔的临界值，引起细胞质膜结构暂时性改变，形成纳米级微孔，dna等外源物质通过这些微孔进入细胞质或细胞核。
大多数细胞通过传统转染技术就可以提高转染效率，而原代细胞、免疫细胞、神经细胞、干细胞等难以通过传统方法获得高转染效率，成为困扰科研人员的难题。nepa gene公司在细胞转染和融合领域拥有超过二十年的研究经验，其代表产品nepa21高效基因转染系统自上市以来受到了国内外众多科学家的青睐。在干细胞转染方面，如ips、esc、hsc和msc等细胞，nepa21均被研究者们用于转染实验中，积累了丰富的转染条件、细胞转染效率和基因编辑效率等宝贵的经验和数据。
案例一使用nepa21电转染仪将mrna导入hesc
参考文献：gene manipulation of human embryonic stem cells by in vitro-synthesized mrna for gene therapy
转染物质：gfp / dsred mrna
电转参数：电压125v（文中只写明电压，详细参数可咨询）
在本研究中，作者通过体外转录合成多种类型的mrna，使用nepa21电转仪将其导入到hesc中，以研究mrna在hesc中的转染效率和诱导蛋白表达的时间（图1）。同时，为了保证转染效率对hn4细胞系不具有特异性，作者对多种hesc细胞系和ips的转染效率进行了比较。在电穿孔24h后，fcas分析显示，gfp mrna在hn4、ns1、ns2和ips中表达量均在95%以上（图1）。
图1 电穿孔24h后，gfp在不同细胞系中的转染效率
在电穿孔后，是否能维持胚胎干细胞的多能性仍需要进一步的检测。在此，研究人员通过免疫荧光法检测了两种常见的标志基因（oct4和ssea4）。结果显示，转染24h后，大多数表达gfp的细胞仍然呈oct4阳性和ssea4阳性。
图2 电穿孔24h后，hn4细胞中oct4和ssea4基因的表达
此外，研究人员还证明采用电穿孔法可以有效地将gfp和dsred mrna共转染至hn4细胞中（图3）。
图2 gfp和dsred mrna共转染
案例二使用nepa21进行ipsc电转及基因编辑（crsipr/talens）
参考文献：
1.precise correction of the dystrophin gene in duchenne muscular dystrophy patient induced pluripotent stem cells by talen and crispr-cas9.
2. efficient genomic correction methods in human ips cells using crispr–cas9 system
转染物质：egfp质粒、敲除实验（talens: 5μg left + 5μg right或crispr: 5μg cas9 + 5μg sgrna）、敲入实验（5μg donor vector + talens（5μg left + 5μg right）或crispr（5μg cas9 + 5μg sgrna））
电转参数：电压125v、脉冲时长5ms、脉冲次数2
为了在ips细胞中获得最高的质粒转染效率，研究人员使用egfp质粒转染了3种ips细胞系（201b7、404c2、dmd-ipsc），优化脉冲电压、脉冲时间等转染条件。结果如下图所示：
图4 ipsc转染条件优化
使用nepa21优化转染条件之后，通过talen和crispr两种方法对ipsc的dmd基因进行敲除和敲入实验，基因编辑效率如下：
knockout：
图5 ipsc基因敲除效率
knockin：
图6 ipsc基因敲入效率
案例三使用nepa21进行hsc转染条件优化及基因编辑（crispr）
参考文献：non-viral ex vivo genome-editing in mouse bona fide hematopoietic stem cells with crispr/cas9
转染质粒：crispr/rnp
电转参数：穿孔参数（电压100v、脉冲时长5ms、脉冲次数8）、转移参数（电压10v、脉冲时长50ms、脉冲次数5），本文使用1mm间隔电转杯
在这项研究中，研究者旨在通过连续移植来评估真正的hscs的基因组编辑效率。为了避免病毒整合到hsc基因组中，采用了非病毒转染方法（电穿孔）来编辑小鼠hsc的基因组。首先通过电穿孔将cas9/rnp转移到体外的hsc中，随后通过三次细胞移植来检验真正的hsc的敲除效率。此外，通过基因插入，还成功地证明了对小鼠hscs中x-scid突变的基因校正，从而治愈了小鼠。
研究人员首先以gfp为报告基因，通过nepa21在小鼠骨髓系阴性细胞（lin-）中优化了电穿孔条件，并通过gfp荧光和7-氨基-放线jun素d（7-aad）染色检测细胞转染效率和细胞存活率。结果显示，在电压100v、脉冲时间5ms、脉冲次数8次的电转条件下，细胞转染效率>60%，存活率>50%，可作为后续实验的电穿孔参数（图7）。
图7 hsc转染效率
随后，将针对itga2b基因外显子1和2的rnp复合体电穿孔转染至lin-细胞。在体外培养1~2周后，通过surveyor实验检测到itga2b外显子1和2的突变，并且将基因编辑后的lin-细胞通过连续移植后仍能检测到15%定点突变效率，证明了基因编辑发生在真正的hsc中（图8）。
图8 在hsc中敲除itga2b结果
为了恢复x-scid小鼠的il2rg基因功能，研究者采取了基于nhej和同源无关的靶向整合（hiti）的策略，将il2rg外显子2-8（hiti-cdnaex2-8）整合到il2rg的内含子1。他们先在nih3t3细胞中测试了该方法，通过nepa21电转仪导入il2rg内含子1的grna与cas9（cas9/rnp-il2rgin1），在nih 3t3细胞中有效地产生了43.1%的突变。基于此，进一步检测了在lin-细胞中的基因插入效率，通过surveyor分析和扩增序列测定，细胞基因突变效率为20.2%（图9）。
图9 在hsc中对il2rg基因插入结果
本文中提到，cas9/rnp通过电穿孔到造血干细胞，可以不使用任何病毒载体，基因编辑技术为基因位点的特异性修饰提供了可能。非整合病毒如腺病毒或腺相关病毒（aav）经常被用来传递crispr/cas9，但它们会在宿主中激发对组成性表达的cas9的免疫反应。相反，cas9/rnp在转导细胞中迅速降解，从而逃避宿主的免疫反应，更重要的是，电穿孔与其他传递方法相比，产生的脱靶dsb更少。
案例四使用nepa21电转msc的最佳条件
参考文献：电穿孔法转染脐带华通胶间充质干细胞的最佳条件
转染物质：eev-egfp质粒
电转参数：电压150v、脉冲时长5ms、脉冲间隔50ms、脉冲次数2
本文采用电穿孔法将质粒eev-egfp转入华通胶间充质干细胞（wj-msc），并通过流式细胞仪检测转染率，以探讨不同电穿孔条件对wj-msc转染效率的影响，确定最佳电转染条件。
研究人员测试了不同电压（125，130，140，150，170v）、不同脉冲时间（2.5，5.0，7.5ms）、不同细胞状态（体积分数为20%正常氧、体积分数为5%低氧）对wj-msc电转染效率的影响。电穿孔后48h进行检测，转染质粒携带egfp绿色荧光标签，转染成功的wj-msc将表达绿色荧光蛋白，使用流式细胞仪检测荧光表达率。
结果表明，正常培养的wj-msc在电压150v、脉冲时长5.0ms、脉冲间隔时间50ms、脉冲数2次时可达到较高的电转染率。
图10 不同转染条件下wj-msc的转染效率
总结
较高的电穿孔条件可以更有效地编辑基因组，但会对细胞造成较大损伤，而较弱的电转染条件对细胞更温和，但细胞转染效率和编辑效率可能较低。因此，为基因组编辑效率和细胞活力找到一个可接受的条件是十分重要的。nepa21采用全新四步法电转程序，可对细胞穿孔模式和基因转移模式中的所有参数进行单独设置（电压、脉冲时长、脉冲间隔、脉冲次数和衰减比例），非常有利于难转染细胞的参数优化，提高转染效率。
nepa21高效基因转染系统采用全新设计的电转程序，配合电压衰减设计，在获得高转染效率的同时，提高细胞存活率。操作简单，电转参数可见可调，适用性强。特别适用于难转染的原代免疫细胞、干细胞、神经细胞、外泌体、类器官、活体动物、受精卵及宫内胚胎等的转染，已应用于众多著名期刊文献中，是进行细胞悬浮/贴壁状态、活体和离体组织转染的电转系统主流品牌之一。
本文引用的案例均为已发表文献，想了解nepa21更多应用案例或实验细节可咨询。
end
广州市艾贝泰生物科技有限公司立足于生物工艺的优化、放大及生产，除了为国内客户提供高品质的applikon生物反应器，还引进了先进产品，如nepa21 高效基因转染系统、nova生化分析仪、cytena克隆筛选单细胞打印机系统、kaiser拉曼在线生物工艺分析仪、flownamics在线取样器、constantsystems高压细胞破碎仪等。为满足生物制药行业高速发展的需要，艾贝泰也专业研发和生产一次性使用的生物工艺设备和耗材，现可提供取样、补料、储液、配液过程中所需的无菌袋以及搅拌、称重系统等，同时提供定制化服务，力求帮助客户优化培养工艺、降低研发成本、更快通过相关验证。艾贝泰不断完善生物制药领域的产品线，为用户提供详细的专业产品解决方案。
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图1 电穿孔24h后，gfp在不同细胞系中的转染效率
在电穿孔后，是否能维持胚胎干细胞的多能性仍需要进一步的检测。在此，研究人员通过免疫荧光法检测了两种常见的标志基因（oct4和ssea4）。结果显示，转染24h后，大多数表达gfp的细胞仍然呈oct4阳性和ssea4阳性。
图2 电穿孔24h后，hn4细胞中oct4和ssea4基因的表达
此外，研究人员还证明采用电穿孔法可以有效地将gfp和dsred mrna共转染至hn4细胞中（图3）。
图2 gfp和dsred mrna共转染
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图10 不同转染条件下wj-msc的转染效率
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