荧光定量PCR仪的误区

荧光定量pcr 因操作方便、运行速度快、实验结果准确，受到越来越多的分子生物学研究者青睐。在实验技术成熟的今天，也许对你来说，难得不是实验技术上的问题——而是选择哪种荧光定量pcr仪——你要征询实验室成员的意见、分析实验室目前乃至将来的需求、平衡实验室的预算，更要详细研究各种富诱惑力的宣传资料。面对各种不同性能的产品，您又该如何选择呢？先建议大走出认识荧光定量pcr的两个误区：误区：仪器通道越多越好随着pcr技术的成熟运用，多重扩增越来越热闹，荧光定量pcr仪也不能幸免。从初abi公司推出的单通道荧光定量pcr仪发展到如今各个厂都推出4通道、5通道甚至6通道荧光定量pcr仪，眼花缭乱的选择让人无所适从，就有人不小心走进了“通道越多越好”的误区。在使用有些厂5通道的荧光定量仪时，为了确保实验结果的性和准确性都要在实验中使用rox（种荧光染料）或的reference dye ，这些荧光染料都必须单独使用个检测通道。这样以来，真正能检测多重pcr荧光信号的有效通道只有4个，而且使用校正染料可能会增加后期的使用成本。有的荧光定量pcr的检测通道是只为自已厂的的荧光染料或试剂开放的，有效检测通道也非像宣传资料**称的那么多。在购买前确认荧光定量pcr仪器的有效检测通道尤为重要，不能单单只听宣传。考虑多重荧光定量pcr的通道数的时候也应该从实验室实际情况出发，多重pcr并非人人适用、人人可用，因为它使实验复杂化了。误区：real-time pcr仪无需梯度功能对于使用染料法的定量pcr反应，虽然有各种各样的pcr引物设计软件或者经验公式计算熔解温度（tm值），但运用的公式不同、引物序列不同，tm值的差异会很大。引物的熔解温度决定了退火温度。而且模版中碱基的组合千变万化，对于特殊片断，经验公式得到的数据不定能得出准确的结果，退火温度细微的差异对结果都可能产生决定性的影响，因而“摸条件”度是让人很头疼的问题。梯度pcr的出现部分解决了些问题——在反应过程中每个孔的温度控制条件可以在范围内按照梯度变化，根据结果，步就可以摸索出适合的反应条件。不单退火温度，连变性温度和延伸温度都可以化——对于多种聚合酶混合酶扩增如invitrogen、clontech、promega的多数保真taq酶来说这个非常重要，因为taq和校正酶的反应温度可能有显著差异，化延伸温度就显得很重要。使用有梯度功能的荧光定量pcr可以次完成以往多次实验才能完成的化过程，简化了摸索 pcr反应条件的繁琐实验，既节省实验时间提效率，又节省实验成本。

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