类器官RNA和蛋白提取方法
很多老师咨询类器官rna和蛋白如何提取，其实类器官可以按微小组织进行rna和蛋白提取，今天小爱给大家讲一讲提取方法。
类器官蛋白提取方法
一、试剂准备（细胞浆、细胞核及细胞膜蛋白抽提试剂盒(abs9346)）
1、准备溶液
1）室温融解试剂盒中的各种溶液，溶解后除结构蛋白提取液外，其他试剂立即置于冰上；
2）结构蛋白提取液溶解后，可放置于37℃水浴中温浴至透明后，常温放置。
2、蛋白提取工作液的准备
1）胞浆蛋白提取工作液的准备：临用前，根据处理样品的量估算实验时胞浆蛋白提取液的需要量，并分别按照1:50比例加入磷酸酶抑制剂ii和1:100比例加入蛋白酶抑制剂pmsf；
2）胞核蛋白提取工作液的准备：临用前，根据处理样品的量估算实验时胞核蛋白提取液的需要量，并分别按照1:50比例加入磷酸酶抑制剂ii和1:100比例加入蛋白酶抑制剂pmsf；
3）膜蛋白提取工作液的准备：临用前，根据处理样品的量估算实验时膜蛋白提取液的需要量，并分别按照1:50比例加入磷酸酶抑制剂ii和1:100比例加入蛋白酶抑制剂pmsf；
4）结构蛋白提取工作液的制备：临用前，根据处理样品的量估算实验时结构蛋白提取液的需要量，并分别按照1:50比例加入磷酸酶抑制剂ii和1:100比例加入蛋白酶抑制剂pmsf。
二、类器官收集及洗涤
1、类器官收集
移液器吸去培养基，每孔添加1-2ml左右4℃类器官传代培养缓冲液(abs9730)，轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中（24孔板，每5孔为一组），4℃静置10min或-20℃放置5min（目的是使基质胶软化），300g ，4℃， 离心5min弃上清。
2、类器官清洗
添加1ml类器官传代培养缓冲液重悬，300g ，4℃，离心5min弃上清。
三、类器官蛋白提取
1、胞浆蛋白提取
1）向含类器官沉淀的ep中加入2ml的胞浆蛋白提取工作液，在4℃条件下震荡20min；
2）准备1-5ml的注射器，用注射器吹打步骤1震荡过的溶液50-90次，在4℃条件下，15000g离心10min。取上清液存于ep管中，即为胞浆蛋白。
2、胞核蛋白的提取
取3.1.2步骤获得的沉淀物加入4ml冰浴的胞浆蛋白提取工作液，在4℃条件下震荡5min，4℃条件下15000g离心10min，弃去上清液，沉淀物中加入1ml冰冻的胞核蛋白提取工作液，在4℃条件下震荡5min，4℃条件下15000g离心10min，上清液为细胞核蛋白，转入ep管并保存。
3、胞膜蛋白的提取
在步骤3.2中的沉淀物中加入1ml冰冻的膜蛋白提取工作液，在4℃条件下震荡5min，4℃条件下15000g离心10min，上清液为细胞膜蛋白，转入ep管并保存。
4、结构蛋白的提取
在步骤3.3的沉淀物中加入常温或37℃水浴过的透明的结构蛋白提取工作液0.5ml，4℃条件下震荡5min，4℃条件下15000g离心10min，保存上清液即为细胞骨架蛋白。
5、待测蛋白的保存待检测浓度的蛋白存于-70℃，可以用于western，emsa，footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。
类器官rna提取方法
一、类器官收集及洗涤
1、类器官收集
移液器吸去培养基，每孔添加1-2ml左右4℃类器官传代培养缓冲液(abs9730)，轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中（24孔板，每5孔为一组），4℃静置10min或-20℃放置5min（目的是使基质胶软化），300g ，4℃， 离心5min弃上清。
2、类器官清洗
添加1ml类器官传代培养缓冲液重悬，转移到1.5ml ep管，300g ，4℃，离心5min弃上清。
二、类器官rna提取（超纯总rna快速提取试剂盒(含dnase i)，货号abs60026）
1、向含类器官沉淀的ep中加入1ml的rl（试剂盒组分）溶解细胞，并用移液枪轻轻吹打混匀，使rl充分和类器官接触裂解细胞并灭活rna酶；
2、将匀浆样品剧烈震荡混匀，在15-30°c条件下孵育5min以使核蛋白体分解；
3、每1ml rl加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15sec并将其在室温下孵育3min；
4、于4℃，12000 rpm离心10min，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，rna存在于水相中。水相层的容量大约为所加rl体积的60%，把水相转移到新管中，进行下一步操作；
5、加入1倍体积70％乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!），颠倒混匀（此时可能会出现沉淀）。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱ra中（吸附柱套在收集管内）；
6、12000 rpm 离心45sec，弃废液，将吸附柱重新套回收集管；
7、加400μl去蛋白液re，12000 rpm 离心45sec，弃废液；
8、dnase i工作液的配制：取10μl dnase i储存液放入新的rnase-free离心管中，加入70μl rdd溶液，轻柔混匀；
9、向吸附柱ra中央加入80μl dnase i工作液，室温放置15min（一般情况下室温放置可得到较好的消化效果，如果室温效果不佳可选择在37℃放置15min）；
10、加400μl去蛋白液re，12000 rpm 离心45sec，弃掉废液；
11、加入500μl漂洗液rw（请先检查是否已加入无水乙醇！），12000 rpm离心45sec， 弃掉废液；
12、加入500μl漂洗液rw，12000 rpm 离心45sec，弃掉废液；
13、将吸附柱ra放回空收集管中，12000 rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；
14、取出吸附柱ra，放入一个rnase free离心管中，根据预期rna产量往吸附膜的中间部位加50-80μl rnase free h2o（事先在 65℃水浴中加热效果更好），室温放置2min，12000 rpm 离心1min，所得溶液即为rna溶液。如果需要较多rna，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1min。
提取得到的rna溶液，可以直接应用于northern 杂交、rt-pcr、real time rt-pcr、cdna文库构建、体外翻译等各种常规分子生物学实验。
今天讲解就到这了，大家如有实验问题，欢迎公众号“爱必信生物”后台交流哦！
本期小爱推荐：
货号
品名
规格
abs9346
细胞浆、细胞核及细胞膜蛋白抽提试剂盒
50t
abs60026
超纯总rna快速提取试剂盒（含dnase i）
20t/50t
abs9730
类器官传代培养缓冲液
250ml/ 250ml
abs9495
基质胶（低因子、无酚红）
1.5ml*4/ 1.5ml*8
abs9444
organotial人肝癌类器官培养基试剂盒
1kit
abs9445
organotial人结直肠癌类器官培养基试剂盒
1kit
abs9443
organotial人肺癌类器官培养基试剂盒
1kit
abs9449
organotial人胃癌类器官培养基试剂盒
1kit
abs9447
organotial人胰腺癌类器官培养基试剂盒
1kit
abs9589
organotial人鼻咽癌类器官培养基试剂盒
1kit
abs9739
organotial人脑胶质瘤类器官培养基试剂盒
1kit
abs9446
organotial人乳腺癌类器官培养基试剂盒
1kit
好消息！absin文献奖励重磅升级！
absin特色产品线：
wb相关：ecl发光液、预染marker、预制胶；ihc相关：二抗试剂盒、组化笔；ip/coip试剂盒；激动剂/抑制剂；血清、bsa、蛋白酶k、ctb、ttx、cee；凋亡试剂盒；呼吸爆发试剂盒；elisa试剂盒；重组蛋白；抗体: 二抗、标签抗体、对照抗体；定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)...
参与科技重大专项 民营仪表企业发展迎利好
出厂合格的钢板防护罩要符合哪些要求
冷却器投用后日常检查维护工作
压电陶瓷极化专用电源及高压放大器选择参考，国产可信可买
V型滤池罗茨鼓风机的作用与工作原理以及安装步骤
类器官RNA和蛋白提取方法
防尘盖土网价格
能谱科技：利用红外光谱法对汽车润滑油使用所产生中硝化物的分析
影响金刚石砂轮堵塞的两个因素
L型二氧化碳纯度测定仪 路途包破损
GDJ301-AT7光电开关的特点
安装雷达液位计需要注意什么？
数控机床故障的几种诊断方法
如何使用多头数显恒温磁力搅拌器？
珠海羽人水稻精量直播无人机助力2019珠海市春耕生产暨农业科技、放心农资 农业机械“三下乡”
应如何做好药品防护？
R412027217型德国AVENTICS安全阀满足出厂的合格标准有六个
Z44H快速排污阀安装说明
弯管机故障后如何去维修？
选择德诚旺；选择聚四氟乙烯
类器官蛋白提取方法
一、试剂准备（细胞浆、细胞核及细胞膜蛋白抽提试剂盒(abs9346)）
1、准备溶液
1）室温融解试剂盒中的各种溶液，溶解后除结构蛋白提取液外，其他试剂立即置于冰上；
2）结构蛋白提取液溶解后，可放置于37℃水浴中温浴至透明后，常温放置。
2、蛋白提取工作液的准备
1）胞浆蛋白提取工作液的准备：临用前，根据处理样品的量估算实验时胞浆蛋白提取液的需要量，并分别按照1:50比例加入磷酸酶抑制剂ii和1:100比例加入蛋白酶抑制剂pmsf；
2）胞核蛋白提取工作液的准备：临用前，根据处理样品的量估算实验时胞核蛋白提取液的需要量，并分别按照1:50比例加入磷酸酶抑制剂ii和1:100比例加入蛋白酶抑制剂pmsf；
3）膜蛋白提取工作液的准备：临用前，根据处理样品的量估算实验时膜蛋白提取液的需要量，并分别按照1:50比例加入磷酸酶抑制剂ii和1:100比例加入蛋白酶抑制剂pmsf；
4）结构蛋白提取工作液的制备：临用前，根据处理样品的量估算实验时结构蛋白提取液的需要量，并分别按照1:50比例加入磷酸酶抑制剂ii和1:100比例加入蛋白酶抑制剂pmsf。
二、类器官收集及洗涤
1、类器官收集
移液器吸去培养基，每孔添加1-2ml左右4℃类器官传代培养缓冲液(abs9730)，轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中（24孔板，每5孔为一组），4℃静置10min或-20℃放置5min（目的是使基质胶软化），300g ，4℃， 离心5min弃上清。
2、类器官清洗
添加1ml类器官传代培养缓冲液重悬，300g ，4℃，离心5min弃上清。
三、类器官蛋白提取
1、胞浆蛋白提取
1）向含类器官沉淀的ep中加入2ml的胞浆蛋白提取工作液，在4℃条件下震荡20min；
2）准备1-5ml的注射器，用注射器吹打步骤1震荡过的溶液50-90次，在4℃条件下，15000g离心10min。取上清液存于ep管中，即为胞浆蛋白。
2、胞核蛋白的提取
取3.1.2步骤获得的沉淀物加入4ml冰浴的胞浆蛋白提取工作液，在4℃条件下震荡5min，4℃条件下15000g离心10min，弃去上清液，沉淀物中加入1ml冰冻的胞核蛋白提取工作液，在4℃条件下震荡5min，4℃条件下15000g离心10min，上清液为细胞核蛋白，转入ep管并保存。
3、胞膜蛋白的提取
在步骤3.2中的沉淀物中加入1ml冰冻的膜蛋白提取工作液，在4℃条件下震荡5min，4℃条件下15000g离心10min，上清液为细胞膜蛋白，转入ep管并保存。
4、结构蛋白的提取
在步骤3.3的沉淀物中加入常温或37℃水浴过的透明的结构蛋白提取工作液0.5ml，4℃条件下震荡5min，4℃条件下15000g离心10min，保存上清液即为细胞骨架蛋白。
5、待测蛋白的保存待检测浓度的蛋白存于-70℃，可以用于western，emsa，footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。
类器官rna提取方法
一、类器官收集及洗涤
1、类器官收集
移液器吸去培养基，每孔添加1-2ml左右4℃类器官传代培养缓冲液(abs9730)，轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中（24孔板，每5孔为一组），4℃静置10min或-20℃放置5min（目的是使基质胶软化），300g ，4℃， 离心5min弃上清。
2、类器官清洗
添加1ml类器官传代培养缓冲液重悬，转移到1.5ml ep管，300g ，4℃，离心5min弃上清。
二、类器官rna提取（超纯总rna快速提取试剂盒(含dnase i)，货号abs60026）
1、向含类器官沉淀的ep中加入1ml的rl（试剂盒组分）溶解细胞，并用移液枪轻轻吹打混匀，使rl充分和类器官接触裂解细胞并灭活rna酶；
2、将匀浆样品剧烈震荡混匀，在15-30°c条件下孵育5min以使核蛋白体分解；
3、每1ml rl加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15sec并将其在室温下孵育3min；
4、于4℃，12000 rpm离心10min，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，rna存在于水相中。水相层的容量大约为所加rl体积的60%，把水相转移到新管中，进行下一步操作；
5、加入1倍体积70％乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!），颠倒混匀（此时可能会出现沉淀）。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱ra中（吸附柱套在收集管内）；
6、12000 rpm 离心45sec，弃废液，将吸附柱重新套回收集管；
7、加400μl去蛋白液re，12000 rpm 离心45sec，弃废液；
8、dnase i工作液的配制：取10μl dnase i储存液放入新的rnase-free离心管中，加入70μl rdd溶液，轻柔混匀；
9、向吸附柱ra中央加入80μl dnase i工作液，室温放置15min（一般情况下室温放置可得到较好的消化效果，如果室温效果不佳可选择在37℃放置15min）；
10、加400μl去蛋白液re，12000 rpm 离心45sec，弃掉废液；
11、加入500μl漂洗液rw（请先检查是否已加入无水乙醇！），12000 rpm离心45sec， 弃掉废液；
12、加入500μl漂洗液rw，12000 rpm 离心45sec，弃掉废液；
13、将吸附柱ra放回空收集管中，12000 rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；
14、取出吸附柱ra，放入一个rnase free离心管中，根据预期rna产量往吸附膜的中间部位加50-80μl rnase free h2o（事先在 65℃水浴中加热效果更好），室温放置2min，12000 rpm 离心1min，所得溶液即为rna溶液。如果需要较多rna，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1min。
提取得到的rna溶液，可以直接应用于northern 杂交、rt-pcr、real time rt-pcr、cdna文库构建、体外翻译等各种常规分子生物学实验。
今天讲解就到这了，大家如有实验问题，欢迎公众号“爱必信生物”后台交流哦！
本期小爱推荐：
货号
品名
规格
abs9346
细胞浆、细胞核及细胞膜蛋白抽提试剂盒
50t
abs60026
超纯总rna快速提取试剂盒（含dnase i）
20t/50t
abs9730
类器官传代培养缓冲液
250ml/ 250ml
abs9495
基质胶（低因子、无酚红）
1.5ml*4/ 1.5ml*8
abs9444
organotial人肝癌类器官培养基试剂盒
1kit
abs9445
organotial人结直肠癌类器官培养基试剂盒
1kit
abs9443
organotial人肺癌类器官培养基试剂盒
1kit
abs9449
organotial人胃癌类器官培养基试剂盒
1kit
abs9447
organotial人胰腺癌类器官培养基试剂盒
1kit
abs9589
organotial人鼻咽癌类器官培养基试剂盒
1kit
abs9739
organotial人脑胶质瘤类器官培养基试剂盒
1kit
abs9446
organotial人乳腺癌类器官培养基试剂盒
1kit
好消息！absin文献奖励重磅升级！
absin特色产品线：
wb相关：ecl发光液、预染marker、预制胶；ihc相关：二抗试剂盒、组化笔；ip/coip试剂盒；激动剂/抑制剂；血清、bsa、蛋白酶k、ctb、ttx、cee；凋亡试剂盒；呼吸爆发试剂盒；elisa试剂盒；重组蛋白；抗体: 二抗、标签抗体、对照抗体；定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)...
参与科技重大专项 民营仪表企业发展迎利好
出厂合格的钢板防护罩要符合哪些要求
冷却器投用后日常检查维护工作
压电陶瓷极化专用电源及高压放大器选择参考，国产可信可买
V型滤池罗茨鼓风机的作用与工作原理以及安装步骤
类器官RNA和蛋白提取方法
防尘盖土网价格
能谱科技：利用红外光谱法对汽车润滑油使用所产生中硝化物的分析
影响金刚石砂轮堵塞的两个因素
L型二氧化碳纯度测定仪 路途包破损
GDJ301-AT7光电开关的特点
安装雷达液位计需要注意什么？
数控机床故障的几种诊断方法
如何使用多头数显恒温磁力搅拌器？
珠海羽人水稻精量直播无人机助力2019珠海市春耕生产暨农业科技、放心农资 农业机械“三下乡”
应如何做好药品防护？
R412027217型德国AVENTICS安全阀满足出厂的合格标准有六个
Z44H快速排污阀安装说明
弯管机故障后如何去维修？
选择德诚旺；选择聚四氟乙烯