外泌体制备方法
外泌体制备，便宜又好用的方法
外泌小体（exosome）是一种囊泡结构，直径通常在30-150nm，常见于正常体液和病理样本，培养细胞也可分泌。研究人员已经在血液、唾液、尿液、母乳等中发现外泌小体，其运载的蛋白和核酸涉及其细胞间物资、信息交流，影响和调控着多方面的生理功能，包括肿瘤发生、免疫促进、凋亡调控、血管生成、炎症反应及发育和分化 等。由于在体液中出现，外泌小体对于临床生物标志物检测特别有 利，成为体外诊断、biomarker研究的新热点。
近年来随着分离纯化技术的提高，关于外泌小体的研究成果颇丰；这进一步吸引了越来越多领域的课题将外泌体纳入研究对象。研究的前提是方便、高效、标准化地分离纯化外泌小体。经过近20年的探索，已经建立了超速离心法、沉淀法、色谱法、亲和纯化法等。在大量实践中大家逐渐认识到根据下游研究对样品的要求，以及起始样品的规模、数量，可以选择不同的外泌体制备策略。因不需要特殊的设备和试剂盒，对操作人员也没有特别的经验要求，超滤法成为实验室中制备外泌体的通用方法。
参考方案
两步法细胞上清的外泌体分离
超滤方法纯化具体操作步骤举例
amicon® ultra-15 超滤管 (10 kda mwco)
● 用steriflip真空抽滤对样品进行澄清[目录号 scgpo0525; 0.22um millipore express plus (pes)膜]
● 用pbs平衡amicon ultra-15超滤管( 目录号ufc901096，10kda) ，离心 4000g x 10 min。
● 从超滤管内管及收集管吸走 pbs。
● 向超滤管加入15ml 样品。
● 4000g 离心30min.浓缩。
● 倒空收集管。
● 加入14 ml pbs进行缓冲液置换，温柔吸打样品数次。
● 4000g离心30 min。
● 从浓缩管吸回处理好的样品。(30x 浓缩)
注意: 所有 amicon ultra 超滤管(0.5,2,4 和15 ml)与此操作流程兼容*
注意事项及补充提示
● 无血清样品选择 3kda 孔径是为了尽可能提高外泌体的回收率。
● 有血清样品选择 100kda/500kda 孔径是为了尽可能去除细胞分泌蛋白以及血清成分中小于外泌体的白蛋白造成的影响。
● 研究者可根据样品的粘稠程度，以及需要制备的目标外泌体 / 囊泡 / 颗粒的大小分布来选择和优化超滤孔径(3kda/ 10kda/ 30kda/ 50kda/ 100kda)，以便达到更好的得率和操作体验。
● 样品体积大于 30ml 时可以考虑用超滤杯或 centricon plus -70 超管，请注意搅拌式超滤杯在 200ml 以内时吸附损
耗可能较离心式超滤管略偏高。
● 如需进一步提高特定外泌体的纯度，可选用包被相应抗体的磁珠进行亲和纯化精制。
不同方法制备外泌小体产量比较
超滤法制备的外泌小体参考数据
多维度分析4 个sh-sy-5y 细胞系的外泌小体样品
(含或不含血清)
默克生命科学过滤超滤产品组合
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近年来随着分离纯化技术的提高，关于外泌小体的研究成果颇丰；这进一步吸引了越来越多领域的课题将外泌体纳入研究对象。研究的前提是方便、高效、标准化地分离纯化外泌小体。经过近20年的探索，已经建立了超速离心法、沉淀法、色谱法、亲和纯化法等。在大量实践中大家逐渐认识到根据下游研究对样品的要求，以及起始样品的规模、数量，可以选择不同的外泌体制备策略。因不需要特殊的设备和试剂盒，对操作人员也没有特别的经验要求，超滤法成为实验室中制备外泌体的通用方法。
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● 从超滤管内管及收集管吸走 pbs。
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● 4000g 离心30min.浓缩。
● 倒空收集管。
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● 4000g离心30 min。
● 从浓缩管吸回处理好的样品。(30x 浓缩)
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● 有血清样品选择 100kda/500kda 孔径是为了尽可能去除细胞分泌蛋白以及血清成分中小于外泌体的白蛋白造成的影响。
● 研究者可根据样品的粘稠程度，以及需要制备的目标外泌体 / 囊泡 / 颗粒的大小分布来选择和优化超滤孔径(3kda/ 10kda/ 30kda/ 50kda/ 100kda)，以便达到更好的得率和操作体验。
● 样品体积大于 30ml 时可以考虑用超滤杯或 centricon plus -70 超管，请注意搅拌式超滤杯在 200ml 以内时吸附损
耗可能较离心式超滤管略偏高。
● 如需进一步提高特定外泌体的纯度，可选用包被相应抗体的磁珠进行亲和纯化精制。
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