多聚*标签（His-tag）
固定化金属离子亲合层析(immobilizedmetalionaffinitychromatography,imac)，简称金属螯合亲合层析，是一种新型的应用于原核蛋白纯化的技术。该方法通过蛋白质表面的一些特殊的氨基酸，使之与金属离子发生相互作用，从而对蛋白质进行亲和纯化。这些作用包括配价键结合、静电吸附、共价键结合等，其中以6个*残基组合的融合标签（his-tag）在原核蛋白表达中的应用zui为显著。
his-tag可结合在目的蛋白的c末端或n末端，形成特殊的结构，以便于进行下一步的纯化及检测。由于金属螯合亲合层析具有配体简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点，所以可选择范围广，高盐，存在变性剂以及去垢剂的上样条件下进行纯化，his-tag正逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品zui有效的技术之一。
his-tag作为蛋白纯化时的标签，其优势在于：
1.n-端的his-tag与细菌的转录翻译机制兼容，有利于蛋白表达；
2.采用imac（固定化金属离子亲合层析）纯化his-tag融合蛋白操作更加简便；
3.his-tag对目的蛋白本身特性几乎没有影响，不会改变目的蛋白本身的可溶性和生物学功能；
4.his-tag非常小，在融合蛋白结晶后对蛋白的结构没有影响；his-tag的免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射入动物体内进行免疫并制备抗体；
5.与其它亲和标签构建成双亲和标签，并可应用于多种表达系统；
his-tag融合蛋白的适用范围也较广，既可以在非离子型表面活性剂存在的条件下纯化，也可以在变性条件下进行纯化。前者通常用来纯化疏水性强的目的蛋白，而后者则通常纯化包涵体蛋白。
his-tag亲和层析填料
his-tag可与多种金属离子发生特殊的相互作用，如ca2+、mg2+、ni2+、cu2+，fe3+等，其原理是利用蛋白质表面的特性，使之被吸附在凝胶柱上，从而达到分离纯化蛋白的目的。
ni2+在亲和纯化实验中的使用。根据结合基团的不同，ni2+亲和层析柱可分为俩类——ni-ida和ni-nta。ni2+有六个螯合价位，其中ni-ida螯合了三价，ni-nta螯合了四价。所以ida的载量要比nta的高，在同样条件下ni-ida洗脱时的咪唑浓度也高于ni-nta。但其弱的结合力使金属离子在洗脱阶段时很容易浸出，与目的蛋白紧密结合，从而导致分离蛋白产量偏低，产品不纯及金属离子污染等问题。而nta的颗粒粒度均匀，粒径更小，并且螯合镍更稳定，能耐受较高的还原剂，使填料更加稳定，镍离子不易脱落。
imac在通常的情况下是比较稳定的，但螯合剂的存在则会导致其金属离子脱落。例如在e.coli的裂解液中普遍存在一些非特异的弱螯合剂，如在三羧酸循环中产生了二羧酸类物质。因此，e.coli在某些高压情况下就会产生高特异性的金属螯合剂（通常存在于细菌的细胞周质中），导致his-tag融合蛋白纯化的纯度和产量大大降低。所以在进行纯化his-tag融合蛋白的实验时，首先需要去除螯合剂。
ni-nta亲和层析实验
ni-nta分离带his标签的重组蛋白
1.ni-nta装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml；
2.用缓冲液1平衡2~5个床体积，流速为2ml/min；
3.将20ml细胞破碎液(50mmpbs，ph7.4，0.5mnacl)0.45um滤膜过滤，上样，流速为1ml/min；
4.用缓冲液1再洗2~5个床体积，流速为2ml/min；
5.用分别含10、20、50、100、200、300、400mm咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱，流速为2ml/min，收集各阶段洗脱峰，用sds-page检测融合蛋白的分子量大小和纯度；
6.用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于低温环境中保存。
缓冲液组成：
缓冲液1：50mmph7.4的pbs缓冲液。
配制：0.5mnah2po419ml，0.5mna2hpo481ml，nacl29.3g，加适量水溶解后定容到1000ml。
缓冲液2：50mm磷酸盐缓冲液，ph7.4，即ph7.4的pbs溶液。
配制：0.5mnah2po419ml，0.5mna2hpo481ml，nacl29.3g和咪唑34g,加适量，水调ph后定容到1000ml。
缓冲液3：不同咪唑浓度的缓冲液b
配制：
咪唑洗脱原理：ni柱中的氯化镍可以与有his-tag的融合蛋白结合，也可以与咪唑进行结合，当标签蛋白与层析柱表面珠孔内的镍离子介质发生结合时，不同浓度的咪唑通过层析柱，就会将与镍配位的标签蛋白，杂蛋白等分别洗脱下来，从而得到高纯度目标蛋白。
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5.与其它亲和标签构建成双亲和标签，并可应用于多种表达系统；
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his-tag亲和层析填料
his-tag可与多种金属离子发生特殊的相互作用，如ca2+、mg2+、ni2+、cu2+，fe3+等，其原理是利用蛋白质表面的特性，使之被吸附在凝胶柱上，从而达到分离纯化蛋白的目的。
ni2+在亲和纯化实验中的使用。根据结合基团的不同，ni2+亲和层析柱可分为俩类——ni-ida和ni-nta。ni2+有六个螯合价位，其中ni-ida螯合了三价，ni-nta螯合了四价。所以ida的载量要比nta的高，在同样条件下ni-ida洗脱时的咪唑浓度也高于ni-nta。但其弱的结合力使金属离子在洗脱阶段时很容易浸出，与目的蛋白紧密结合，从而导致分离蛋白产量偏低，产品不纯及金属离子污染等问题。而nta的颗粒粒度均匀，粒径更小，并且螯合镍更稳定，能耐受较高的还原剂，使填料更加稳定，镍离子不易脱落。
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1.ni-nta装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml；
2.用缓冲液1平衡2~5个床体积，流速为2ml/min；
3.将20ml细胞破碎液(50mmpbs，ph7.4，0.5mnacl)0.45um滤膜过滤，上样，流速为1ml/min；
4.用缓冲液1再洗2~5个床体积，流速为2ml/min；
5.用分别含10、20、50、100、200、300、400mm咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱，流速为2ml/min，收集各阶段洗脱峰，用sds-page检测融合蛋白的分子量大小和纯度；
6.用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于低温环境中保存。
缓冲液组成：
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配制：0.5mnah2po419ml，0.5mna2hpo481ml，nacl29.3g，加适量水溶解后定容到1000ml。
缓冲液2：50mm磷酸盐缓冲液，ph7.4，即ph7.4的pbs溶液。
配制：0.5mnah2po419ml，0.5mna2hpo481ml，nacl29.3g和咪唑34g,加适量，水调ph后定容到1000ml。
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