一种免疫胶体金冻干方法示例
免疫胶体金定性检测因其快速、简便，在医院检验科已广泛应用，用于妊娠早期诊断的人绒毛膜*(hcg)胶体金法诊断试剂制造及检定规程已由中国生物制品规程公布，但尚未能达到定量的水平。免疫胶体金技 术常用于定性检测微生物感染，近年上已有商品化免疫胶体金定量检测试剂供应，较有代表性的是挪威axis-shield公司生产的nycocardc 反应蛋白定量、尿微量白蛋白定量、d-二聚体定量试剂盒，他们使用超微颗粒胶体金和硼酸盐缓冲液使液相免疫胶体金有较好的稳定性(nycocardl 114365.ed.581july2001)，但尚未见有hcg胶体金冻干品。
免疫胶体金技术快速又简便，所以广受欢迎，但要测定结果非常准确， 则免疫胶体金必须有良好的稳定性，这在免疫胶体金定量检测中尤为重要，是发展金标法快速定量检测试剂的前提。
*生物制品冻干形式可以延长其有效期，在产品运输过程中不必低温运输。但免疫胶体金的胶体性能使它在冻干中会发生破乳现象，严重的破乳会造成肉眼可见的颗粒凝聚。轻度的破乳引起的微量颗粒凝聚， 在检测过程中因直径增大而通不过微孔纤维膜，滞留在膜上的红色凝聚颗 粒就误报为假阳性的结果。因此胶体金的冻干存在技术突破。
解决的技术问题是克服液相免疫胶体金稳定性差的缺陷以及 胶体金冻干品制备中的破乳现象，提供一种具有良好稳定性，能定量检测 人绒毛膜*(hcg)的胶体金冻干品。
一种定量检测人绒毛膜*(hcg)胶体金冻干品的制备方法包括如下步骤：
1.制备抗hcg抗体包被胶体金
常规制备空白的粒径20nm左右的胶体金，呈透明的红色或桔红色， ph5.4～5.6，在520nm、1厘米光径时光吸收值od在0.9～1.2。然后以 抗hcg抗体包被胶体金，抗体包被浓度0.01～0.05mg/ml，离心作结合/ 游离(b/f)分离；
2.制备胶体金溶液：
(1)混合裂解与不裂解的2，2’-[(1-甲基亚乙基)双(4，1-亚苯基 甲醛)]双环氧乙烷聚乙二醇衍生化合物。
浓度分别为：裂解物0.2mg～10.0mg/m1；不裂解物 0.2mg～10.0mg/ml。
上述裂解或不裂解物在上述浓度范围内可以用任意比例混合，优 选比例是1∶1；
以上双环氧乙烷聚乙二醇衍生化合物的裂解采用如下方法；
称聚乙二醇衍生化合物(美国sigama公司，产品编号p2263，mp59 ℃，白色片状结晶，溶于水，分子量15000～20000)50克，置三角烧瓶中 在石棉网上以微火加热使其熔化，保持微沸4～5分钟，室温冷却到40～50℃时加入1升蒸馏水，均匀溶解后即为5％裂解物；称上述聚乙二醇衍生化 合物50克，加入1升蒸馏水，均匀溶解后即为5％不裂解物。
(2)离心分离后的抗hcg胶体金沉淀以原体积1/5的含上述裂解和不裂 解物各2mg/ml、1～12％蔗糖、10-20mm磷酸盐缓冲液ph7.4悬浮；
3.制备胶体金冻干品
将胶体金溶液在-40℃预冻，转入冻干机作冷冻干燥，升温≤25℃。
b/f分离时如不加稳定剂，离心后全部胶体金消失，只剩下少许片状金属不溶物，加入不同的稳定剂保护。
od值越高说明片状金属不溶物越少，稳定剂的效果越显著。2，2’-[(1- 甲基亚乙基)双(4，1-亚苯基甲醛)]双环氧乙烷聚乙二醇衍生化合物或其裂解物或二者混合物为稳定剂时的od值相对传统稳定剂聚乙二醇20000 (peg)较高，保护*。
上述稳定剂也可用于其它免疫胶体金，例如葡萄球菌a蛋白(spa)- 胶体金缀合物，用于临床血清样品中有关病原体的igg抗体检测。
制备免疫胶体金冻干品时除了含有上述稳定剂(裂解或不裂解聚 乙二醇衍生化合物)外，必须含有1～12％蔗糖，否则冻干品必会有轻度的破乳，引发一定数量的假阳性，蔗糖的加入量在此范围即可，与其它稳定剂无比例关系。
以上出自作者徐建新的《定量检测人绒毛膜*胶体金冻干品及制备方法》。
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*生物制品冻干形式可以延长其有效期，在产品运输过程中不必低温运输。但免疫胶体金的胶体性能使它在冻干中会发生破乳现象，严重的破乳会造成肉眼可见的颗粒凝聚。轻度的破乳引起的微量颗粒凝聚， 在检测过程中因直径增大而通不过微孔纤维膜，滞留在膜上的红色凝聚颗 粒就误报为假阳性的结果。因此胶体金的冻干存在技术突破。
解决的技术问题是克服液相免疫胶体金稳定性差的缺陷以及 胶体金冻干品制备中的破乳现象，提供一种具有良好稳定性，能定量检测 人绒毛膜*(hcg)的胶体金冻干品。
一种定量检测人绒毛膜*(hcg)胶体金冻干品的制备方法包括如下步骤：
1.制备抗hcg抗体包被胶体金
常规制备空白的粒径20nm左右的胶体金，呈透明的红色或桔红色， ph5.4～5.6，在520nm、1厘米光径时光吸收值od在0.9～1.2。然后以 抗hcg抗体包被胶体金，抗体包被浓度0.01～0.05mg/ml，离心作结合/ 游离(b/f)分离；
2.制备胶体金溶液：
(1)混合裂解与不裂解的2，2’-[(1-甲基亚乙基)双(4，1-亚苯基 甲醛)]双环氧乙烷聚乙二醇衍生化合物。
浓度分别为：裂解物0.2mg～10.0mg/m1；不裂解物 0.2mg～10.0mg/ml。
上述裂解或不裂解物在上述浓度范围内可以用任意比例混合，优 选比例是1∶1；
以上双环氧乙烷聚乙二醇衍生化合物的裂解采用如下方法；
称聚乙二醇衍生化合物(美国sigama公司，产品编号p2263，mp59 ℃，白色片状结晶，溶于水，分子量15000～20000)50克，置三角烧瓶中 在石棉网上以微火加热使其熔化，保持微沸4～5分钟，室温冷却到40～50℃时加入1升蒸馏水，均匀溶解后即为5％裂解物；称上述聚乙二醇衍生化 合物50克，加入1升蒸馏水，均匀溶解后即为5％不裂解物。
(2)离心分离后的抗hcg胶体金沉淀以原体积1/5的含上述裂解和不裂 解物各2mg/ml、1～12％蔗糖、10-20mm磷酸盐缓冲液ph7.4悬浮；
3.制备胶体金冻干品
将胶体金溶液在-40℃预冻，转入冻干机作冷冻干燥，升温≤25℃。
b/f分离时如不加稳定剂，离心后全部胶体金消失，只剩下少许片状金属不溶物，加入不同的稳定剂保护。
od值越高说明片状金属不溶物越少，稳定剂的效果越显著。2，2’-[(1- 甲基亚乙基)双(4，1-亚苯基甲醛)]双环氧乙烷聚乙二醇衍生化合物或其裂解物或二者混合物为稳定剂时的od值相对传统稳定剂聚乙二醇20000 (peg)较高，保护*。
上述稳定剂也可用于其它免疫胶体金，例如葡萄球菌a蛋白(spa)- 胶体金缀合物，用于临床血清样品中有关病原体的igg抗体检测。
制备免疫胶体金冻干品时除了含有上述稳定剂(裂解或不裂解聚 乙二醇衍生化合物)外，必须含有1～12％蔗糖，否则冻干品必会有轻度的破乳，引发一定数量的假阳性，蔗糖的加入量在此范围即可，与其它稳定剂无比例关系。
以上出自作者徐建新的《定量检测人绒毛膜*胶体金冻干品及制备方法》。
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