抑菌环试验
1 目 的
测定抗（抑）菌产品对细菌和真菌的抗（抑）菌作用。
2 原 理
利用抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度，以显示其抑菌作用。试验通过抑菌环大小以判断其是否具有抑菌能力。本试验适用于抑菌剂与溶出性抗（抑）菌产品的抗（抑）菌效果鉴定。
3 实验材料及器材
（1）实验菌株 *（atcc 6538）、大肠杆菌（8099 或atcc 11229）、白色念珠菌（atcc 10231）菌悬液及根据抑菌剂特定用途所用的其他菌悬液
（2）抑菌剂载体 5mm 直径圆形新华一号定性滤纸片，经压力蒸汽灭菌处理后，置 120℃ 烤干2h，保存备用
（3）活菌培养计数所需器材
（4）微量移液器 5μl～50μl，可调式
（5）游标卡尺
（6）营养琼脂培养基、胰蛋白胨大豆琼脂培养基与沙堡琼脂培养基
4 操作程序
（1）抑菌片的制备：对液体抑菌剂，取无菌并干燥的滤纸片。每片滴加实际使用浓度抑菌剂溶液 5μl，然后将滤纸片平放于清洁的无菌平皿内，开盖置恒温培养箱（37℃）中烤干，或置室温下自然干燥后备用。溶出性抗（抑）菌产品，可直接制成直径为 5mm，厚不超过 4mm 圆片（块），每 4 片（块） 一组。
（2）阴性对照样片的制备：取无菌干燥滤纸片，每片滴加无菌蒸馏水5μl，干燥后备用。 溶出性抗（抑）菌产品的阴性对照样本， 应取同种材质不含抑菌成份的样品，制成与试验组大小相同的样片（块）。
（3）试验菌的接种：用无菌棉拭子蘸取浓度为 5×105cfu/ml～5×106cfu/ml 试验菌悬液，在适宜的培养基平板表面均匀涂抹3次。每涂抹1次，平板应转动 60°，zui后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿，置室温干燥 5min。
（4）抑菌剂样片贴放：每次试验贴放1个染菌平板，每个平板贴放4片试验样片， 1 片阴性对照样片，共 5 片。用无菌镊子取样片贴放于平板表面。各样片中心之间相距 25mm 以上， 与平板的周缘相距 15mm 以上。贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面。盖好平皿，置 37℃恒温培养箱，培养 16h～18h 观察结果。用游标卡尺测量抑菌环的直径（包括贴片）并记录。
（5）试验重复3次。
（6）测量抑菌环时，应选均匀而*无菌生长的抑菌环进行。测量其直径应以抑菌环外沿为界。 4
5评价规定
（1）抑菌作用的判断：
抑菌环直径大于 7mm 者，判为有抑菌作用。 抑菌环直径小于或等于 7mm 者，判为无抑菌作用。
（2）3 次重复试验（共12个样片）均有抑菌作用结果者，判为合格。
（3）阴性对照组应无抑菌环产生。否则试验无效。
6 注意事项
（1）每次试验均应设置阴性对照。在报告中亦必须将对照组的结果列出。
（2）接种用细菌悬液的浓度应符合要求。浓度过低，接种菌量少，抑菌环常因之增大；浓度过高，接种量过多，抑菌环则可减小。
（3）应保持琼脂浓度的准确性，否则可影响抑菌环的大小。
（4）培养时间不得超过 18h。培养过久，部分细菌可恢复生长，抑菌环变小。
（5）抑菌环直径可受抑菌剂的量、抑菌性能和干湿度影响。故抑菌剂滤纸片应在试验当天制备。
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3 实验材料及器材
（1）实验菌株 *（atcc 6538）、大肠杆菌（8099 或atcc 11229）、白色念珠菌（atcc 10231）菌悬液及根据抑菌剂特定用途所用的其他菌悬液
（2）抑菌剂载体 5mm 直径圆形新华一号定性滤纸片，经压力蒸汽灭菌处理后，置 120℃ 烤干2h，保存备用
（3）活菌培养计数所需器材
（4）微量移液器 5μl～50μl，可调式
（5）游标卡尺
（6）营养琼脂培养基、胰蛋白胨大豆琼脂培养基与沙堡琼脂培养基
4 操作程序
（1）抑菌片的制备：对液体抑菌剂，取无菌并干燥的滤纸片。每片滴加实际使用浓度抑菌剂溶液 5μl，然后将滤纸片平放于清洁的无菌平皿内，开盖置恒温培养箱（37℃）中烤干，或置室温下自然干燥后备用。溶出性抗（抑）菌产品，可直接制成直径为 5mm，厚不超过 4mm 圆片（块），每 4 片（块） 一组。
（2）阴性对照样片的制备：取无菌干燥滤纸片，每片滴加无菌蒸馏水5μl，干燥后备用。 溶出性抗（抑）菌产品的阴性对照样本， 应取同种材质不含抑菌成份的样品，制成与试验组大小相同的样片（块）。
（3）试验菌的接种：用无菌棉拭子蘸取浓度为 5×105cfu/ml～5×106cfu/ml 试验菌悬液，在适宜的培养基平板表面均匀涂抹3次。每涂抹1次，平板应转动 60°，zui后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿，置室温干燥 5min。
（4）抑菌剂样片贴放：每次试验贴放1个染菌平板，每个平板贴放4片试验样片， 1 片阴性对照样片，共 5 片。用无菌镊子取样片贴放于平板表面。各样片中心之间相距 25mm 以上， 与平板的周缘相距 15mm 以上。贴放好后，用无菌镊子轻压样片，使其紧贴于平板表面。盖好平皿，置 37℃恒温培养箱，培养 16h～18h 观察结果。用游标卡尺测量抑菌环的直径（包括贴片）并记录。
（5）试验重复3次。
（6）测量抑菌环时，应选均匀而*无菌生长的抑菌环进行。测量其直径应以抑菌环外沿为界。 4
5评价规定
（1）抑菌作用的判断：
抑菌环直径大于 7mm 者，判为有抑菌作用。 抑菌环直径小于或等于 7mm 者，判为无抑菌作用。
（2）3 次重复试验（共12个样片）均有抑菌作用结果者，判为合格。
（3）阴性对照组应无抑菌环产生。否则试验无效。
6 注意事项
（1）每次试验均应设置阴性对照。在报告中亦必须将对照组的结果列出。
（2）接种用细菌悬液的浓度应符合要求。浓度过低，接种菌量少，抑菌环常因之增大；浓度过高，接种量过多，抑菌环则可减小。
（3）应保持琼脂浓度的准确性，否则可影响抑菌环的大小。
（4）培养时间不得超过 18h。培养过久，部分细菌可恢复生长，抑菌环变小。
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