qPCR曲线常见问题有哪些？如何解决？
在 qpcr 实验过程中，经常会遇到异常扩增曲线和熔解曲线的困扰，那么qpcr曲线常见问题有哪些呢？该如何解决呢？让我们一起来看看吧！
一、扩增曲线相关问题
1.无扩增曲线
可能原因：
（1）没有打开荧光信号采集。检查程序设置，三步法扩增程序在 72℃ 延伸阶段采集信号，两步法扩增程序的信号采集设置在退火延伸步骤。
（2）引物降解。可通过 page 电泳检验引物的完整性。
（3）模板浓度低。建议增加模板投入量或重新制备较高浓度模板。
2. 扩增曲线不光滑
可能原因：
（1）仪器长时间未校准，在检测中出现了波动，建议定期校准仪器；
（2）rna 模板不纯，建议增大模板稀释倍数或者重新制备较高纯度的 rna 模板。
3. 扩增曲线平台期抖动
可能原因：仪器与管材不匹配导致的信号采集产生波动。
4. 扩增曲线右下方下落呈倒扣状
可能的原因：模板浓度过高，基线终点值大于 ct 值，仪器默认起峰位置仍为基线期，将起峰位置往基线下拉，所以扩增曲线变成了倒扣的 s 形（左图）。可适当减小基线范围，手动调整基线终点值至 ct 值 -4，调整基线范围后，扩增曲线即恢复正常（右图）。
二、熔解曲线相关问题
1. 有扩增曲线无溶解曲线
可能原因：检查是否有设置熔解曲线步骤或熔解曲线信号采集是否打开。
2. 熔解曲线杂峰
（1）杂峰在主峰之前
可能的原因：杂峰在主峰之前，tm 在 70～75℃ 范围内，一般是引物二聚体。引物二聚体是引物 3’ 端的部分碱基互补结合，在 taq 酶的作用下，3’ 端延伸后得到的小分子量的双链 dna 片段。可根据 ntc（无模板阴性对照）判断是否为引物二聚体。
解决方案：建议通过提高模板浓度、提高退火温度、降低引物浓度来改善。
（2）杂峰在主峰之后
可能的原因：非特异性扩增，可能由于引物特异性较差，或体系中有气溶胶污染（可结合 ntc 确定体系是否有污染）。建议先提高退火温度，可提高扩增特异性。如果提高退火温度对于特异性没有改善，建议更换特异性较高的引物。
更多有关qpcr曲线常见问题及解决方法，请联系北京百奥创新科技有限公司：
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（3）模板浓度低。建议增加模板投入量或重新制备较高浓度模板。
2. 扩增曲线不光滑
可能原因：
（1）仪器长时间未校准，在检测中出现了波动，建议定期校准仪器；
（2）rna 模板不纯，建议增大模板稀释倍数或者重新制备较高纯度的 rna 模板。
3. 扩增曲线平台期抖动
可能原因：仪器与管材不匹配导致的信号采集产生波动。
4. 扩增曲线右下方下落呈倒扣状
可能的原因：模板浓度过高，基线终点值大于 ct 值，仪器默认起峰位置仍为基线期，将起峰位置往基线下拉，所以扩增曲线变成了倒扣的 s 形（左图）。可适当减小基线范围，手动调整基线终点值至 ct 值 -4，调整基线范围后，扩增曲线即恢复正常（右图）。
二、熔解曲线相关问题
1. 有扩增曲线无溶解曲线
可能原因：检查是否有设置熔解曲线步骤或熔解曲线信号采集是否打开。
2. 熔解曲线杂峰
（1）杂峰在主峰之前
可能的原因：杂峰在主峰之前，tm 在 70～75℃ 范围内，一般是引物二聚体。引物二聚体是引物 3’ 端的部分碱基互补结合，在 taq 酶的作用下，3’ 端延伸后得到的小分子量的双链 dna 片段。可根据 ntc（无模板阴性对照）判断是否为引物二聚体。
解决方案：建议通过提高模板浓度、提高退火温度、降低引物浓度来改善。
（2）杂峰在主峰之后
可能的原因：非特异性扩增，可能由于引物特异性较差，或体系中有气溶胶污染（可结合 ntc 确定体系是否有污染）。建议先提高退火温度，可提高扩增特异性。如果提高退火温度对于特异性没有改善，建议更换特异性较高的引物。
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