1,5-二磷酸核酮糖化酶(Rubisco)试剂盒的正确使用方法
1,5-二磷酸核酮糖化酶(rubisco)试剂盒的正确使用方法
核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶（ribulose-1，5-bisphosphale carboxylase，rubpcase）是光合作用碳代谢中的重要的调节酶，是植物中最丰富的蛋白质，主要存在于叶绿体的可溶部分，总量约占叶绿体可溶蛋白50%~60%。本实验分别用分光光度法和同位素法测定酶的羧化能力。
二磷酸核酮糖叛化酶(ec 4.1.1.39)是植物光合作用中的一个关键酶，既控制着co2的固定，同时又制约着碳素向calvin循环和光呼吸循环分流，其活性的大小直接影响着光合速率。测定原理;在rubisco的催化下，1分子的核酮糖-1,5-二磷酸rubp)与1分子的co,结合，产生2分子的3-磷酸甘油酸(pga)，pga可通过外加的3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，产生甘油醛-3-磷酸，并使还原型辅酶i(nadh)氧化。因此，340nm吸光度的变化可计算还原型辅酶i氧化速率，还原型辅酶i氧化速率可反映rubisco的活性。
自备的仪器和用品:
可见-紫外分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、lml石英比色皿、研钵、冰、蒸馆水。
四、试剂的组成和配制:
提取液一:液体25mlx1瓶，4c保存:提取液二:液体25mlx1瓶，4c保存:
试剂一: 30mlx1瓶，4c保存:
试剂二:粉剂x1瓶，-20c保存，临用前加入12.5ml试剂一，充分混匀备用，用不完的试剂分装后-20c保存，禁止反复冻融:试剂三:粉剂x1瓶，-20c保存，临用前加入12.5ml试剂一，充分混匀备用，用不完的试剂分装后-20c保存，禁止反复冻融:试剂四:粉剂x1瓶，-20c保存，临用前加入1.25ml试剂一，充分混备用，用不完的试剂分装后-20保存，禁止反复冻融;(注意:试剂二、三、四济解后，按需分装-20c保存。)
五、样本本处理:
1、总rubisco酶提取:建议称取约0.1g样本，加入ml提取液一，冰浴匀浆后超声破碎(冰浴，200w.
破碎3s，间歇7s，总时间1min)，然后4c，8000g离心10min，取上清测定。
胞浆和叶体rubisco的分离:按照物组织质量(g):提取液体积(ml)为1:5-10的比例(建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液一)，冰浴匀浆后于4c，200g离心5min，分离并保留沉淀，取上清在4c，8000g下离心10min，取上清用于测定胞浆rubisco酶活性:取沉淀加1ml提取液二，震荡溶解后超声破碎(冰浴，200w，破碎3s，间歇7s，总时间1min)，然后4c，8000g离心10min，取上清测定叶绿体中rubisco酶活性。
建议测定总rubisco活性，按照步1提取液，要分别测定胞和叶绿体中的rubisco，则按照步骤2提取粗液。(注意:粗酶液制备过程中超声破碎操作使用细胞破碎仪进行。)
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关键词：紫外分光光度计 恒温水浴锅 台式离心机 移液器 细胞破碎仪
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试剂一: 30mlx1瓶，4c保存:
试剂二:粉剂x1瓶，-20c保存，临用前加入12.5ml试剂一，充分混匀备用，用不完的试剂分装后-20c保存，禁止反复冻融:试剂三:粉剂x1瓶，-20c保存，临用前加入12.5ml试剂一，充分混匀备用，用不完的试剂分装后-20c保存，禁止反复冻融:试剂四:粉剂x1瓶，-20c保存，临用前加入1.25ml试剂一，充分混备用，用不完的试剂分装后-20保存，禁止反复冻融;(注意:试剂二、三、四济解后，按需分装-20c保存。)
五、样本本处理:
1、总rubisco酶提取:建议称取约0.1g样本，加入ml提取液一，冰浴匀浆后超声破碎(冰浴，200w.
破碎3s，间歇7s，总时间1min)，然后4c，8000g离心10min，取上清测定。
胞浆和叶体rubisco的分离:按照物组织质量(g):提取液体积(ml)为1:5-10的比例(建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液一)，冰浴匀浆后于4c，200g离心5min，分离并保留沉淀，取上清在4c，8000g下离心10min，取上清用于测定胞浆rubisco酶活性:取沉淀加1ml提取液二，震荡溶解后超声破碎(冰浴，200w，破碎3s，间歇7s，总时间1min)，然后4c，8000g离心10min，取上清测定叶绿体中rubisco酶活性。
建议测定总rubisco活性，按照步1提取液，要分别测定胞和叶绿体中的rubisco，则按照步骤2提取粗液。(注意:粗酶液制备过程中超声破碎操作使用细胞破碎仪进行。)
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