大肠杆菌概述及菌株的分型
大肠杆菌作为外源基因表达的宿主,遗传背景清楚,技术操作简单,培养条件简单,大规模发酵经济,倍受遗传工程专家的重视.目前大肠杆菌是应用zui广泛,最成功的表达体系,常做高效表达的shou选体系。真核基因在大肠杆菌中表达,必须有合适的表达载体(vector),常用载体:pbv220,pet系统。
一、目的基因在大肠杆菌中表达的情况:
大肠杆菌更适合原核基因的表达,外源基因表达产量与单位体积产量是正相相关的,而单位体积产量与细胞浓度和每个细胞平均表达产量呈正相相关.细胞浓度与生长速率,外源基因拷贝数和表达 产物产量之间存在动态平衡,单个细胞的产量又与外源基因拷贝数,基因表达效率,表达产物的稳定性和细胞代谢负荷等因素有关。
二、大肠杆菌的菌落形态：
大肠杆菌在普通琼脂培养基上面都是一样的,圆形边缘整齐，表面光滑，半透明，小凸起；典型的大肠杆菌在伊红美蓝琼脂平板上的特征为：深紫黑色、光滑、湿润、带有金属光泽的圆形菌落。
大肠杆菌是动物肠道中的正常寄居菌，其中很小一部分在一定条件下引起疾病 。大肠杆菌的血清型能够引起人体或动物胃肠道感染，主要是由特定的菌毛抗原、致病性毒素等感染引起的，除胃肠道感染以外，还会引起尿道感染、关节炎、脑膜炎以及败血型感染等。
三、大肠杆菌菌株的分型：
1：dh5a菌株
dh5a是一种常用于质粒克隆的菌株。e.colidh5a在使用puc系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。
基因型：f-，φ80dlaczδm15，δ(laczya-argf)u169，deor，reca1，enda1，hsdr17(rk-，mk+)，phoa，supe44，λ-，thi-1，gyra96，rela1
2：bl21(de3)菌株
该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体t7启动子的表达载体（如pet系列）的基因。t7噬菌体rna聚合酶位于λ噬菌体de3区，该区整合于bl21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。
基因型：f-，ompt，hsds（rbb-mb－），gal，dcm（de3）
3：bl21(de3)plyss菌株
该菌株含有质粒plyss，因此具有氯霉素抗性。plyss含有表达t7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。
基因型：f-，ompthsds（rbb-mb－），gal，dcm（de3，plyss，camr
4：jm109菌株
该菌株在使用puc系列质粒载体进行dna转化或用m13phage载体进行转染时，由于载体dna产生的lacza多肽和jm09编码的laczδm15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株
基因型：reca1，enda1，gyra96，thi－1，hsdr17，supe44，rela1，δ（lac－proab）/f’
5：top 10菌株
该菌株适用于高效的dna克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。
基因型：f-，mcraδ(mrr-hsdrms-mcrbc)，φ80，laczδm15，△lacⅹ74，reca1，araδ139δ(ara-leu)7697，galu，galk，rps，(strr)enda1，nupg
6：hb101菌株
该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验
基因型：supe44，hsds20（rb-mb－），reca13，ara－14，proa2，lacy1，galk2，rpsl20，xyl-5，mtl-1，leub6，thi-1m110或scs110
大多数大肠杆菌菌株中含有dam甲基化酶和dcm甲基化酶，前者可以在gatc序列中腺嘌呤n-6位上引入甲基，后者在cca/tgc序列的第一个胞嘧啶c-5位置上引入甲基。常用的菌株都会产生dam,dcm，从而受到甲基化的影响.部分限制性内切酶对甲基化的dna不能切割，如fbai和mboi等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。大多数酶切位点的甲基化不影响切割，而有些会影响，如xbai,bcli等。而且甲基化只发生在特定序列，以xbai为例，只有在位点序列旁出现ga或tc，该xbai位才会被甲基化。而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法：
（1）选用上述酶的同功酶，如sau3ai，dna识别切割位点与mboi相同；但不受甲基化影响；
（2）利用甲基化酶缺失的受体细胞进行dna的制备，如e.colijm110和链霉菌等，前者dam和dcm甲基化酶已敲出，而后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细胞中抽提的dna就能被上述酶切割。
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一、目的基因在大肠杆菌中表达的情况:
大肠杆菌更适合原核基因的表达,外源基因表达产量与单位体积产量是正相相关的,而单位体积产量与细胞浓度和每个细胞平均表达产量呈正相相关.细胞浓度与生长速率,外源基因拷贝数和表达 产物产量之间存在动态平衡,单个细胞的产量又与外源基因拷贝数,基因表达效率,表达产物的稳定性和细胞代谢负荷等因素有关。
二、大肠杆菌的菌落形态：
大肠杆菌在普通琼脂培养基上面都是一样的,圆形边缘整齐，表面光滑，半透明，小凸起；典型的大肠杆菌在伊红美蓝琼脂平板上的特征为：深紫黑色、光滑、湿润、带有金属光泽的圆形菌落。
大肠杆菌是动物肠道中的正常寄居菌，其中很小一部分在一定条件下引起疾病 。大肠杆菌的血清型能够引起人体或动物胃肠道感染，主要是由特定的菌毛抗原、致病性毒素等感染引起的，除胃肠道感染以外，还会引起尿道感染、关节炎、脑膜炎以及败血型感染等。
三、大肠杆菌菌株的分型：
1：dh5a菌株
dh5a是一种常用于质粒克隆的菌株。e.colidh5a在使用puc系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。
基因型：f-，φ80dlaczδm15，δ(laczya-argf)u169，deor，reca1，enda1，hsdr17(rk-，mk+)，phoa，supe44，λ-，thi-1，gyra96，rela1
2：bl21(de3)菌株
该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体t7启动子的表达载体（如pet系列）的基因。t7噬菌体rna聚合酶位于λ噬菌体de3区，该区整合于bl21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。
基因型：f-，ompt，hsds（rbb-mb－），gal，dcm（de3）
3：bl21(de3)plyss菌株
该菌株含有质粒plyss，因此具有氯霉素抗性。plyss含有表达t7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。
基因型：f-，ompthsds（rbb-mb－），gal，dcm（de3，plyss，camr
4：jm109菌株
该菌株在使用puc系列质粒载体进行dna转化或用m13phage载体进行转染时，由于载体dna产生的lacza多肽和jm09编码的laczδm15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株
基因型：reca1，enda1，gyra96，thi－1，hsdr17，supe44，rela1，δ（lac－proab）/f’
5：top 10菌株
该菌株适用于高效的dna克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。
基因型：f-，mcraδ(mrr-hsdrms-mcrbc)，φ80，laczδm15，△lacⅹ74，reca1，araδ139δ(ara-leu)7697，galu，galk，rps，(strr)enda1，nupg
6：hb101菌株
该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验
基因型：supe44，hsds20（rb-mb－），reca13，ara－14，proa2，lacy1，galk2，rpsl20，xyl-5，mtl-1，leub6，thi-1m110或scs110
大多数大肠杆菌菌株中含有dam甲基化酶和dcm甲基化酶，前者可以在gatc序列中腺嘌呤n-6位上引入甲基，后者在cca/tgc序列的第一个胞嘧啶c-5位置上引入甲基。常用的菌株都会产生dam,dcm，从而受到甲基化的影响.部分限制性内切酶对甲基化的dna不能切割，如fbai和mboi等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。大多数酶切位点的甲基化不影响切割，而有些会影响，如xbai,bcli等。而且甲基化只发生在特定序列，以xbai为例，只有在位点序列旁出现ga或tc，该xbai位才会被甲基化。而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法：
（1）选用上述酶的同功酶，如sau3ai，dna识别切割位点与mboi相同；但不受甲基化影响；
（2）利用甲基化酶缺失的受体细胞进行dna的制备，如e.colijm110和链霉菌等，前者dam和dcm甲基化酶已敲出，而后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细胞中抽提的dna就能被上述酶切割。
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