初榨橄榄油中叶绿素降解产物脱镁叶绿素高效液相色谱荧光检测分析
摘要：本应用简报介绍了一种简便而快速的方法，其采用经改良的光电倍增管 (pmt) 的荧光检 测器 (fld) 来分析特级初榨橄榄油 (evoo) 中叶绿素热降解产物脱镁叶绿素 (pp) 和原焦 脱镁叶绿素 (ppp)。采用 hamamatsu r928ha 红敏 pmt 代替标准 pmt，可以将原始信 号提高约 120 倍。另外，由于基线噪音的降低，总体分析性能提高了 180 倍。本方法对 稀释的 evoo 直接进行分析，无需进行其他的样品前处理，与传统国际标准组织 (iso) 的 固相萃取 (spe)/紫外检测 (uv) 方法相比，该方法不仅降低溶剂消耗量和缩短液相色谱循 环时间，分离度也得到了提高。
前言 evoo 是采用机械方法从橄榄 (olea europaea l.) 中获得的。叶绿 素是存在于 evoo 中的天然绿色色素，已证明其在加工和储存过 程中易于降解为脱镁叶绿素和原焦脱镁叶绿素。在果实研磨和打 浆过程中，叶绿素受酸性条件和加热的影响尤为明显，各成分的密 切接触，往往会释放出酸性化合物，导致大幅度的叶绿素脱镁反 应 [1]。因此可使用叶绿素降解产物作为 evoo 的一个质量参数。 iso 的 ppp 分析方法作为橄榄油标准的一部分，于 2010 年被澳 大利亚和新西兰采用，而其他国家尚待采用。根据所获得的数值 可确定 evoo 的保存是否得当，或者 evoo 是否掺杂了精炼橄 榄油。 iso 29841 中的传统 spe/uv 方法包括几个样品前处理步骤，这 些步骤会耗费大量的溶剂和时间。在改良的 fld 方法中，采用异 丙醇稀释橄榄油样品后即可进行 hplc 进样分析。采用四元溶 剂梯度方法，通过四元梯度泵进行第四种强溶剂（四氢呋喃）冲 洗，不需要对任何溶剂进行预混合，而且还大大减少了前次分析 在色谱柱上残留的橄榄油。此外，采用在红光区更敏感的 pmt 代 替标准 pmt，使 fld 灵敏度提高了 180 倍。
实验部分 仪器配置 iso 29841 spe/uv 方法agilent 1290 infinity 二元液相色谱系统，由化学工作站（版本 c.01.03 [44]）控制，含以下模块：二极管阵列检测器 (dad) 作为 原始 iso 方法的 uv 检测器。 • agilent 1290 infinity 二元泵 (g4220a) • agilent 1290 infinity 自动进样器 (g4226a) • agilent 1290 infinity 柱温箱 (g1316c) • agilent 1290 infinity 二极管阵列检测器 (g4212a) 改良的 fld 方法 agilent 1260 infinity 四元液相色谱系统，由化学工作站（版本 c.01.03 [44]）控制，含以下模块： • agilent 1260 infinity 四元泵 (g4204a) • agilent 1290 infinity 自动进样器 (g4226a) • agilent 1290 infinity 柱温箱 (g1316c) • agilent 1260 infinity 荧光检测器 (g1321b)，配置 hamamatsu r928ha pmt
样品前处理 所有溶剂均为液相色谱级（与液相色谱条件中相同）。新制 milli-q 水来自配置 0.22 µm 膜式终端过滤器 (millipak) 的 milli-q integral 水纯化系统。 iso spe/uv 方法 将约 300 mg 橄榄油样品溶解在 1 ml 石油醚中，充分涡旋混合。 将样品溶液注入 1000 mg/6 ml 硅胶小柱（phenomenex，美国 加利福尼亚州托伦斯）上，用每份 1 ml的石油醚淋洗两次。一旦 溶剂在柱填料顶部排干，用 5 ml的石油醚/乙mi（90:10，v/v） 洗脱非极性物质两次，并弃去。然后，用 5 ml丙酮洗脱脱氧叶绿素 组分，将其收集到一支 10 ml 玻璃试管中，用锡箔盖封（避光）。 用旋转蒸发器在最高 20 °c 下蒸干溶剂，再用 1 ml 丙酮复溶，以 进行下一步 hplc 分析 [2]。
良的 fld 方法 取 200 mg 的橄榄油样品溶解在 1 ml 异丙醇溶剂中，涡旋混合 15 秒。
结果与讨论 图 1 显示了两种 iso 样品前处理和检测方案得到的叠加色谱图， 这两种样品前处理和检测图解分别为 spe/uv（蓝色）和稀释/fld （红色），并使用针对稀释/fld 新开发的改良色谱条件。两种方法 得到的 ppp 值均为 15%（根据公式 1 计算）。两种样品前处理方 法都显示出了良好的 hplc 分离度，脱氧叶绿素 a 和脱氧叶绿素 a’ 的分离度比 iso 法色谱条件有了明显改善。
so spe/uv 方法的样品前处理时间为 30 分钟，hplc分析时间 为 40 分钟或更长。而采用改良后的 uhplc/fld 方法，配置 3.0 × 100 mm c18 柱的四元系统，稀释步骤非常短暂，分析时间缩短 到 25 分钟。与标准 iso 条件相比，uhplc 分析的溶剂消耗量和 总分析时间只有原来的 40% 或更少。这表明分析成本和时间显著 减少，而且还提高了低含量样品的灵敏度。 % ppp = 100 × appp/(app + appp) 其中， % ppp = % 橄榄油样品中原焦脱镁叶绿素的 % 含量 appp = 原焦脱镁叶绿素 a 的峰面积 app = 脱镁叶绿素 a 和脱镁叶绿素 a’ 的总峰面积 公式 1. 橄榄油中 ppp 含量的计算
结论 实验证明，与传统的 iso spe/uv 方法相比，改良的 fld 方法是 一种更有前景的选择。在本实验中，用 r928ha 红敏光电倍增管 取代标准 pmt 后，可以检测低含量的 ppp 样品。从而在时间、 人力、spe 材料和溶剂消耗量等方面，为那些极多样品分析的实 验室节省了大量的成本。
关键词：色谱柱 柱温箱 旋转蒸发器
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实验部分 仪器配置 iso 29841 spe/uv 方法agilent 1290 infinity 二元液相色谱系统，由化学工作站（版本 c.01.03 [44]）控制，含以下模块：二极管阵列检测器 (dad) 作为 原始 iso 方法的 uv 检测器。 • agilent 1290 infinity 二元泵 (g4220a) • agilent 1290 infinity 自动进样器 (g4226a) • agilent 1290 infinity 柱温箱 (g1316c) • agilent 1290 infinity 二极管阵列检测器 (g4212a) 改良的 fld 方法 agilent 1260 infinity 四元液相色谱系统，由化学工作站（版本 c.01.03 [44]）控制，含以下模块： • agilent 1260 infinity 四元泵 (g4204a) • agilent 1290 infinity 自动进样器 (g4226a) • agilent 1290 infinity 柱温箱 (g1316c) • agilent 1260 infinity 荧光检测器 (g1321b)，配置 hamamatsu r928ha pmt
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