GB 5009.223-2014 食品中氨基甲酸乙酯的测定
中华人民共和国国家标准
gb 5009.223-2014
食品安全国家标准
食品中氨基甲酸乙酯的测定
1范围
本标准规定了啤酒﹑葡萄酒﹑黄酒、白酒等酒类以及酱油中氨基甲酸乙酯含量的气相色谱-质谱法测定。
本标准适用于啤酒﹑葡萄酒﹑黄酒﹑白酒等酒类以及酱油中氨基甲酸乙酯含量的测定。
2原理
试样加d5-氨基甲酸乙酯内标后，经过碱性硅藻土固相萃取柱净化、洗脱，洗脱液浓缩后﹐用气相色谱-质谱仪进行测定﹐内标法定量。
3试剂和材料
注：除非另有说明，本标准所用试剂均为分析纯，水为gb/t 6682规定的三级水。
3.1试剂
3.1.1无水硫酸钠（na2so4）。
3.1.2氯化钠（nacl）。
3.1.3正己烷（c6h14）：色谱纯。
3.1.4乙酸乙酯（c4h8o2）：色谱纯。
3.1.5乙醚（c4h10o）：色谱纯。
3.1.6甲醇（ch4o）：色谱纯。
3.1.7碱性硅藻土固相萃取柱：填料4 000 mg，柱容量12 ml。
3.2试剂配制
3.2.1无水硫酸钠：450℃烘烤4 h，冷却后贮存于干燥器中备用。
3.2.2 5%乙酸乙酯-乙醚溶液：取5ml乙酸乙酯，用乙醚稀释到100 ml，混匀待用。
3.3标准品
3.3.1氨基甲酸乙酯标准品（c3h7o2n，cas：51-79-6）：纯度大于99.0%。
3.3.2 d5-氨基甲酸乙酯标准品（c3h2d5no2，cas：73962-07-9）：纯度大于98.0%。
3.4标准溶液配制
3.4.1 d5-氨基甲酸乙酯储备液（1.00 mg/ml）：准确称取0.01g（精确到0.0001g）d5-氨基甲酸乙酯标准品，用甲醇溶解，定容至10 ml，4℃以下保存。
3.4.2 d5-氨基甲酸乙酯使用液（2.00μg/ml）：准确吸取d5-氨基甲酸乙酯储备液（1.00mg/ml）0.10 ml，用甲醇定容至50 ml，4℃以下保存。
3.4.3氨基甲酸乙酯储备液（1.00 mg/ml）：准确称取0.05 g（精确到0.000 1 g）氨基甲酸乙酯标准品，用甲醇溶解﹑定容至50 ml，4℃以下保存，保存期3个月。
3.4.4氨基甲酸乙酯中间液（10.0μg/ml）：准确吸取氨基甲酸乙酯储备液（1.00 mg/ml）1.00 ml，用甲醇定容至100 ml，4℃以下保存，保存期1个月。
3.4.5氨基甲酸乙酯中间液（0.50 g/ml）：准确吸取氨基甲酸乙酯中间液（10.0 ug/ml）5.00 ml，用甲醇定容至100 ml，现配现用。
3.4.6标准曲线工作溶液：分别准确吸取氨基甲酸乙酯中间液（0.50μg/ml）20.0μl，50.0μl，100.0μl、200.0μl，400.0μl，和氨基甲酸乙酯标准中间液（10.0μg/ml）40.0μl，100.0μl于7个1ml容量瓶中，各加2.00μg/ml d5-氨基甲酸乙酯使用液100μl，用甲醇定容至刻度﹐得到10.0 ng/ml、25.0 ng/ml，50.0 ng/ml，100 ng/ml，200 ng/ml，400 ng/ml，1000 ng/ml的标准曲线工作溶液，现配现用。
4仪器和设备
4.1气相色谱-质谱仪，带电子轰击源（ei）源。
4.2涡旋混匀器。
4.3氮吹仪。
4.4固相萃取装置，配真空泵。
4.5超声波清洗机。
4.6马弗炉。
4.7天平：感量为0.1mg和1mg。
5分析步骤
5.1试样制备
样品摇匀，称取2g（精确至0.001 g）样品（啤酒超声5 min脱气后称量），加100.0μl 2.00μg/ml d5-氨基甲酸乙酯使用液﹑氯化钠0.3 g（若为酱油不加氯化钠），超声溶解、混匀后，加样到碱性硅藻土固相萃取柱上﹐在真空条件下﹐将样品溶液缓慢渗入萃取柱中，并静置10 min。经10 ml正己烷淋洗后，用10 ml 5%乙酸乙酯-乙醚溶液以约1ml/min流速进行洗脱﹐洗脱液经装有2g无水硫酸钠的玻璃漏斗脱水后，收集于10 ml刻度试管中，室温下用氮气缓缓吹至约0.5 ml，用甲醇定容至1.00 ml制成测定液﹐供gc/ms分析。
5.2仪器参考条件
气相色谱-质谱仪分析参考条件：
——毛细管色谱柱：db-innowax，30 m×0.25 mm（内径）×0.25μm（膜厚）或相当色谱柱；
——进样口温度：220℃；
——柱温：初温50℃，保持1min，然后以8℃/min升至180℃，程序运行完成后﹐240℃后运行5 min；
——载气：氦气，纯度≥99.999%，流速1ml/ min；电离模式：电子轰击源（ei，能量为70 ev；
——四级杆温度：150℃；
——离子源温度：230℃；
——传输线温度：250℃；
——溶剂延迟：11 min；
——进样方式：不分流进样
——进样量：1μl~2μl；
——检测方式：选择离子监测（sim）；
——氨基甲酸乙酯选择监测离子（m/z）：44、62、74、89，定量离子62；
——d5-氨基甲酸乙酯选择监测离子（m/z）64、76，定量离子64。
5.3定性测定
按方法条件测定标准工作溶液和试样，低浓度试样定性可以减少定容体积，试样的质量色谱峰保留时间与标准物质保留时间的允许偏差小于±2.5%；定性离子对的相对丰度与浓度相当标准工作溶液的相对丰度允许偏差不超过表1的规定。
5.4定量测定
5.4.1标准曲线的制作
将氨基甲酸乙酯标准曲线工作溶液10.0 ng/ml、25.0 ng/ml、50.0 ng/ml、100 ng/ml，
200 ng/ml，400 ng/ml，1 000 ng/ml（内含200 ng/ml d5-氨基甲酸乙酯）进行气相色谱-质谱仪测定，以氨基甲酸乙酯浓度为横坐标，标准曲线工作溶液中氨基甲酸乙酯峰面积与内标d5-氨基甲酸乙酯的峰面积比为纵坐标，绘制标准曲线。
5.4.2试样测定
将试样溶液同标准曲线工作溶液进行测定﹐根据测定液中氨基甲酸乙酯的含量计算试样中氨基甲酸乙酯的含量，其中试样含低浓度的氨基甲酸乙酯时﹐宜采用10.0 ng/ml、25.0 ng/ml、50.0 ng/ml、100 ng/ml，、200 ng/ ml的标准曲线工作溶液绘制标准曲线﹔试样含高浓度氨基甲酸乙酯时﹐宜采用50.0 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、400 ng/ml、1000 ng/ml的标准曲线工作溶液绘制标准曲线。
标准溶液质谱图见附录a。
6分析结果的表述
试样中氨基甲酸乙酯含量按式（l）计算：
式中：
x——样品中氨基甲酸乙酯含量，单位为微克每千克（μg/kg）；
c——测定液中氨基甲酸乙酯的含量，单位为纳克每毫升（ng/ ml）；
v——样品测定液的定容体积，单位为毫升（ml）；
m——样品质量，单位为克（g）；
1 000——换算系数。
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示﹐保留3位有效数。
7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的相对偏差﹐当含量≤50μg/kg时，不得超过算术平均值的15%；当含量≥50μg/kg时，不得超过算术平均值的10%。
8其他
当试样取2g时，本方法氨基甲酸乙酯检出限为2.0μg/kg，定量限为5.0μg/kg。
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gb 5009.223-2014
食品安全国家标准
食品中氨基甲酸乙酯的测定
1范围
本标准规定了啤酒﹑葡萄酒﹑黄酒、白酒等酒类以及酱油中氨基甲酸乙酯含量的气相色谱-质谱法测定。
本标准适用于啤酒﹑葡萄酒﹑黄酒﹑白酒等酒类以及酱油中氨基甲酸乙酯含量的测定。
2原理
试样加d5-氨基甲酸乙酯内标后，经过碱性硅藻土固相萃取柱净化、洗脱，洗脱液浓缩后﹐用气相色谱-质谱仪进行测定﹐内标法定量。
3试剂和材料
注：除非另有说明，本标准所用试剂均为分析纯，水为gb/t 6682规定的三级水。
3.1试剂
3.1.1无水硫酸钠（na2so4）。
3.1.2氯化钠（nacl）。
3.1.3正己烷（c6h14）：色谱纯。
3.1.4乙酸乙酯（c4h8o2）：色谱纯。
3.1.5乙醚（c4h10o）：色谱纯。
3.1.6甲醇（ch4o）：色谱纯。
3.1.7碱性硅藻土固相萃取柱：填料4 000 mg，柱容量12 ml。
3.2试剂配制
3.2.1无水硫酸钠：450℃烘烤4 h，冷却后贮存于干燥器中备用。
3.2.2 5%乙酸乙酯-乙醚溶液：取5ml乙酸乙酯，用乙醚稀释到100 ml，混匀待用。
3.3标准品
3.3.1氨基甲酸乙酯标准品（c3h7o2n，cas：51-79-6）：纯度大于99.0%。
3.3.2 d5-氨基甲酸乙酯标准品（c3h2d5no2，cas：73962-07-9）：纯度大于98.0%。
3.4标准溶液配制
3.4.1 d5-氨基甲酸乙酯储备液（1.00 mg/ml）：准确称取0.01g（精确到0.0001g）d5-氨基甲酸乙酯标准品，用甲醇溶解，定容至10 ml，4℃以下保存。
3.4.2 d5-氨基甲酸乙酯使用液（2.00μg/ml）：准确吸取d5-氨基甲酸乙酯储备液（1.00mg/ml）0.10 ml，用甲醇定容至50 ml，4℃以下保存。
3.4.3氨基甲酸乙酯储备液（1.00 mg/ml）：准确称取0.05 g（精确到0.000 1 g）氨基甲酸乙酯标准品，用甲醇溶解﹑定容至50 ml，4℃以下保存，保存期3个月。
3.4.4氨基甲酸乙酯中间液（10.0μg/ml）：准确吸取氨基甲酸乙酯储备液（1.00 mg/ml）1.00 ml，用甲醇定容至100 ml，4℃以下保存，保存期1个月。
3.4.5氨基甲酸乙酯中间液（0.50 g/ml）：准确吸取氨基甲酸乙酯中间液（10.0 ug/ml）5.00 ml，用甲醇定容至100 ml，现配现用。
3.4.6标准曲线工作溶液：分别准确吸取氨基甲酸乙酯中间液（0.50μg/ml）20.0μl，50.0μl，100.0μl、200.0μl，400.0μl，和氨基甲酸乙酯标准中间液（10.0μg/ml）40.0μl，100.0μl于7个1ml容量瓶中，各加2.00μg/ml d5-氨基甲酸乙酯使用液100μl，用甲醇定容至刻度﹐得到10.0 ng/ml、25.0 ng/ml，50.0 ng/ml，100 ng/ml，200 ng/ml，400 ng/ml，1000 ng/ml的标准曲线工作溶液，现配现用。
4仪器和设备
4.1气相色谱-质谱仪，带电子轰击源（ei）源。
4.2涡旋混匀器。
4.3氮吹仪。
4.4固相萃取装置，配真空泵。
4.5超声波清洗机。
4.6马弗炉。
4.7天平：感量为0.1mg和1mg。
5分析步骤
5.1试样制备
样品摇匀，称取2g（精确至0.001 g）样品（啤酒超声5 min脱气后称量），加100.0μl 2.00μg/ml d5-氨基甲酸乙酯使用液﹑氯化钠0.3 g（若为酱油不加氯化钠），超声溶解、混匀后，加样到碱性硅藻土固相萃取柱上﹐在真空条件下﹐将样品溶液缓慢渗入萃取柱中，并静置10 min。经10 ml正己烷淋洗后，用10 ml 5%乙酸乙酯-乙醚溶液以约1ml/min流速进行洗脱﹐洗脱液经装有2g无水硫酸钠的玻璃漏斗脱水后，收集于10 ml刻度试管中，室温下用氮气缓缓吹至约0.5 ml，用甲醇定容至1.00 ml制成测定液﹐供gc/ms分析。
5.2仪器参考条件
气相色谱-质谱仪分析参考条件：
——毛细管色谱柱：db-innowax，30 m×0.25 mm（内径）×0.25μm（膜厚）或相当色谱柱；
——进样口温度：220℃；
——柱温：初温50℃，保持1min，然后以8℃/min升至180℃，程序运行完成后﹐240℃后运行5 min；
——载气：氦气，纯度≥99.999%，流速1ml/ min；电离模式：电子轰击源（ei，能量为70 ev；
——四级杆温度：150℃；
——离子源温度：230℃；
——传输线温度：250℃；
——溶剂延迟：11 min；
——进样方式：不分流进样
——进样量：1μl~2μl；
——检测方式：选择离子监测（sim）；
——氨基甲酸乙酯选择监测离子（m/z）：44、62、74、89，定量离子62；
——d5-氨基甲酸乙酯选择监测离子（m/z）64、76，定量离子64。
5.3定性测定
按方法条件测定标准工作溶液和试样，低浓度试样定性可以减少定容体积，试样的质量色谱峰保留时间与标准物质保留时间的允许偏差小于±2.5%；定性离子对的相对丰度与浓度相当标准工作溶液的相对丰度允许偏差不超过表1的规定。
5.4定量测定
5.4.1标准曲线的制作
将氨基甲酸乙酯标准曲线工作溶液10.0 ng/ml、25.0 ng/ml、50.0 ng/ml、100 ng/ml，
200 ng/ml，400 ng/ml，1 000 ng/ml（内含200 ng/ml d5-氨基甲酸乙酯）进行气相色谱-质谱仪测定，以氨基甲酸乙酯浓度为横坐标，标准曲线工作溶液中氨基甲酸乙酯峰面积与内标d5-氨基甲酸乙酯的峰面积比为纵坐标，绘制标准曲线。
5.4.2试样测定
将试样溶液同标准曲线工作溶液进行测定﹐根据测定液中氨基甲酸乙酯的含量计算试样中氨基甲酸乙酯的含量，其中试样含低浓度的氨基甲酸乙酯时﹐宜采用10.0 ng/ml、25.0 ng/ml、50.0 ng/ml、100 ng/ml，、200 ng/ ml的标准曲线工作溶液绘制标准曲线﹔试样含高浓度氨基甲酸乙酯时﹐宜采用50.0 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、400 ng/ml、1000 ng/ml的标准曲线工作溶液绘制标准曲线。
标准溶液质谱图见附录a。
6分析结果的表述
试样中氨基甲酸乙酯含量按式（l）计算：
式中：
x——样品中氨基甲酸乙酯含量，单位为微克每千克（μg/kg）；
c——测定液中氨基甲酸乙酯的含量，单位为纳克每毫升（ng/ ml）；
v——样品测定液的定容体积，单位为毫升（ml）；
m——样品质量，单位为克（g）；
1 000——换算系数。
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示﹐保留3位有效数。
7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的相对偏差﹐当含量≤50μg/kg时，不得超过算术平均值的15%；当含量≥50μg/kg时，不得超过算术平均值的10%。
8其他
当试样取2g时，本方法氨基甲酸乙酯检出限为2.0μg/kg，定量限为5.0μg/kg。
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